Samenvatting Moleculaire microbiologie TLSC-MMVIR5D-18 Hogeschool Utrecht.
Het vak bestaat uit 2 tentamens waarvan de samenvatting van virologie een ander document betreft.
Structuur DNA:
- Bestaande uit nucleotiden (met base G-C en A-T)
- Nucleotiden zijn verbonden door Fosfodiesterverbindingen
- Rechtsdraaiende dubbele helix
- Specifieke baseparing door waterstof bruggen
G-C 3 waterstofbruggen
A-T 2 waterstofbruggen
- DNA strengen antiparalel en complementair
- Major en minor groeven
Purine Adenine en Guanine
Pyrimidine Thymine en Cytosine
Nucleotiden bestaan uit:
- Suiker
- Fosfaat (γ-β-α-suiker-base)
- Base
DNA polymerase:
- Template afhankelijk
- Polymerisatie richting 5’3’
- Primer nodig met vrij 3’OH uiteinde
- Exonuclease activiteit 5’3’(primer weghalen)
- Exonuclease activiteit van 3’5’ (proofreading)
Je moet de Sense en de antisense
kunnen herkennen!!
,Door: Moniek Verhagen
RNA polymerase:
- Prokaryoten 1 soort RNA polymerase
- Eukaryoten 3 soorten RNA polymerase
- Polymeriseren van 5’3’
- Gebruiken DNA als template
- Kunnen zelf DNA helices openen (geen helicase nodig!)
- Kunnen verkeerd ingebouwde nucleotiden zelf weghalen
- Geen primer nodig
- Laat bij terminatiesignaal los van DNA template
Laboratoria voor PCR:
Altijd minimaal 3 ruimtes nodig namelijk:
1: Schone ruimte hier staat de mastermix, buffers, reagentia
2: het vieze lab hier heb je bacterien op plaat of het DNA van patientenmonsters
3: PCR ruimte met computer
Evt 4: post PCR hier mogen PCR appjes openen
Reactiemix:
- DNA met target sequentie
- Primerpaar (reverse en forward)
- Alle 4 de dNTPs
20-200 µm van alle 4 de dNTPs te hoge concentratie kan synthese fouten veroorzaken.
- Taq DNA-polymerase hittestabiel, zorgt voor snelle synthese geen 3’ 5’ exonuclease
activiteit dus GEEN proofreading!
- PCR-buffer
Tris-HCL buffer met pH=7.8 is optimaal
- MgCl2 essentiele cofactor voor Taq-polymerase en heeft stabiliserend effect.
Primers:
- Tussen 18-25 nucleotiden lang
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40%-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Geen basenparing mogelijk tussen de primers zelf (primer-dimer)
- Amplicon tussen 75-200bp voor de hoogste efficientie
- Tm (smelttemperatuur) tussen 50-60 graden
- Annealingstemperatuur (Ta ligt vaak 5°C onderde Tm vd primer) temperatuur waarbij
primers hechten aan template
Probe: Moet eerder op DNA binden dan primer, anders bindt polymease al en is de probe mogelijk te
laat met binden. Probe bindt bij 60-70 graden primer bij 40-50
, Door: Moniek Verhagen
Temperatuurcyclus:
Denaturatie (94 °C): waterstof bruggen worden verbroken
Annealing (50-60°C): hybridisatie van primers met het ssDNA, kan alleen bij lagere temperatuur.
Sequentie moet bekend zijn.
Elongatie (72°C): DNA synthese ssds. Bij optimum temperatuur voor gebruikt DNA polymerase.
Real time PCR/Q PCR:
Voordelen:
- Snel
- Veel monsters in een keer
- Gevoelig
- Mogelijkheid om te kwantificeren
- Lag contiminatie risico (gesloten systeem)
- Multiplex mogelijk
Nadelen:
- Niet ideaal voor multiplexen maar wel mogelijk
- Investering in apperatuur
- RNA labiel!!
- DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
De hoeveelheid PCR product in een PCR reactive na een X aantal cycli hangt af van het aantal
startmoleculen in de reactie
Principe Q-PCR:
Door de hoeveelheid PCR product na iedere cyclus te meten is het aantal startmoleculen terug te
berekenen
In werkelijkheid:
hoeveelheid DNA = 2 reactie verloopt steeds minder eficientExponentieel
n
n= aantal cycli
Op lab, reactie steeds
minder efficient
werken
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper moniekverhagen. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €5,99. Je zit daarna nergens aan vast.
