HCO4, hfst 4, ionkanalen en transporters
Voltage clamp methode, is een methode die gebruik maakt van squid giant axons om elektroden in
te stoppen (zie hfst 3). Er zit een elektrode in die waarnemingen kan doen t.o.v. een referentie
elektrode die buiten het axon aanwezig is. Verder zit de axon in een badje met controleerbare
hoeveelheid zouten, zoals natrium en kalium. Middels een voltage/current clamp kan je ervoor
kiezen om de spanning of stroom op een bepaalde waarde vast te zetten.
Patch clamp methode, humane neuronen zijn vele malen kleiner, waardoor er geen
elektrodes in passen. Om onze neuronen te kunnen bestuderen, is er dus een
andere techniek ontwikkelt: de patch clamp methode. Deze maakt gebruik van een
klein glazen pipetje dat het celmembraan kan verstoren. Het pipet heeft een
opening van ongeveer 1-2 micrometer en bevat een elektrode aan de binnenkant. In
de pipet moet ook vloeistof aanwezig zijn, namelijk een vergelijkbare samenstelling
als het cytosol wat betreft zouten, osmotische waarde etc. Vaak wordt een
artificiële hersenvloeistof gebruikt (CSF). Net als bij de voltage clamp methode meet
je een gehele cel en neem je waar hoeveel stromen er plaatsvinden. Dit is mogelijk
doordat er een referentie elektrode buiten de cel geplaatst wordt die niet in de
afbeelding te zien is. Daarbij kan deze methode in levend weefsel uitgevoerd
worden, maar je kan ook een ‘plakje’ hersenweefsel met neuronen in een schaaltje
plaatsen en daar het onderzoek vervolgen. Om het ‘echt’ in vivo te maken, kan je
een gat maken in het schedel van een muis om in een levende muis de patch clamp
methode uit te voeren. Je moet het hoofd daarbij wel vastzetten om goede
metingen uit te kunnen voeren. De patch clamp methode kan dus gebruikt worden
voor gedissocieerde neuronen, plakjes neuronen, hersengebieden of levende muizen.
Kleuren, doordat je met een pipet de cel doorprikt, kan je ervoor kiezen een gekleurde vloeistof in te
brengen, waardoor je de cellen die je onderzoekt ook zichtbaar kan maken. Hierbij wordt vaak een
fluorescente kleurstof gebruikt en je hebt hierbij dus ook een fluorescentiemicroscoop nodig. Op
deze manier kan je zien waar een cel allemaal contact mee maakt.
Kooi van Farraday, om de fluorescentiemicroscoop staat een grote ijzeren ‘kooi’. Deze zorgt ervoor
dat elektrische storing van buitenaf geweerd wordt. Je bent met de patch clamp methode
stromen/spanning aan het meten en het is dus erg belangrijk dat er geen ruis van buitenaf ontstaat.
Patch clamp resultaten, rechts zijn de metingen van een
patch clamp, op een enkele neuron binnen een plakje
neuronen, te zien (A). Je ziet continue allemaal kleine
stroompjes (ruis). Dit komt niet van buitenaf doordat er een
kooi van Farraday om te microscoop heen zit. De ruis komt
door omliggende neuronen. De geclampte neuron staat
namelijk met een heleboel andere neuronen in verbinding
en deze geven continue kleine inputs (een soort achtergrond informatie). B laat vervolgens metingen
zien in 4 verschillende neuronen, waarbij in de 1e regel geen signaal wordt gegeven en de
achtergrondvuring dus afgebeeld staat. In de 2e regel wordt aangegeven wat er gebeurt als je een
paar neuronen in de omgeving stimuleert en daarmee dus ook de cel zelf. Je ziet dat het
vuringspatroon dan al in frequentie toeneemt. Tot slot wordt in regel 3 een heftigere stimulus
afgebeeld en deze levert een nog hogere frequentie. Je ziet dus dat het van belang is welke neuron je
clampt in een plakje hersenweefsel, want ze tonen allemaal een ander vuringspatroon. Dit komt
doordat verschillende neuronen binnengekomen informatie allemaal net iets anders verwerken door
hun samenstelling van ionkanalen (met name Na+ en K+ kanalen).
Single channel patch clamp methode, de patch clamp methode kan niet alleen gebruikt
worden om enkele neuronen waar te nemen wat betreft stroomverwerking, maar kan ook
gebruikt worden om enkele kanalen te onderzoeken. Door de pipet precies op één kanaal te
zetten, kan je stroom door dit kanaal meten.
, Single channel recordings Na+, door voltage clamp te combineren met het
meten van stroom door een enkel kanaal zijn natrium en kalium kanalen
onderzocht. Rechts is te zien wat voor waarnemingen er gedaan zijn als het
membraanpotentiaal boven de drempelwaarde komt (door er stroom op te
zetten). Bij de natriumkanalen kan je zien dat ze over het algemeen heel
kort open gaan. Dit komt overeen met de macroscopische gedachten dat
natriumkanalen heel snel open gaan bij depolarisatie, maar ook snel
geïnactiveerd worden. Wanneer hetzelfde kanaal een 2e keer bekeken
wordt, zie je vrijwel hetzelfde. Bij de 4e meting en 6e meting zien we een
afwijkend/bijzonder resultaat. Het kanaal reageert dus niet elke keer
hetzelfde. Waar die de ene keer direct opengaat en vrij snel sluit, gaat die
de ander keer niet open of gaat die wel open maar inactiveert die veel
later. Het openen en sluiten van natriumkanalen is dus een stochastisch
proces. Het is namelijk een kans dat die open gaat. Wanneer een
gemiddelde wordt genomen van alle opnames is weer hetzelfde te zien als
bij de macroscopische waarnemingen van hoofdstuk 3: het kanaal gaat snel
open, maar inactiveert daarna ook snel. Het enige verschil dat in de
grafieken ook te zien is, is de hoeveelheid stroom. Door één kanaal gaat
natuurlijk veel minder stroom dan door alle natriumkanalen samen van een
cel.
Macro- & microscopisch (Na+), als de bevindingen van de macroscopische
experimenten vergeleken worden met die van de microscopische
experimenten zijn er 3 overeenkomsten: timing, inactivatie en TTX geeft
hetzelfde effect (blokkering Na+ kanalen). Een extra waarneming die is
gedaan, is dat het een stochastisch proces is of een kanaal opengaat of niet.
Single channel recordings K+, voor kaliumkanalen kan
hetzelfde worden gedaan. Deze stroom gaat de andere kant
op en begint later, daarbij inactiveert het kanaal niet. Net als
bij de natruimkanalen laat 1 kanaal ook een stroom door van
zo’n 2 pA. Daarbij is het openen en sluiten van de
kaliumkanalen ook een stochastisch proces en dat wordt duidelijk in 6e meting van
eenzelfde kanaal, waarin het kanaal veel later opengaat. Ook is te zien dat het soms
tussendoor dichtgaat. Wat tot slot nog opvallend is, is dat de hoeveelheid stroom die uit
een kaliumkanaal vloeit, groter is dan de hoeveelheid die uit een natriumkanaal vloeit
(vergelijk de 3e afbeelding van elke kanaal). Er stromen dus meer kaliumionen de cel uit
dan dat er natriumionen ingaan.
Activatie curves, de
stochasticiteit is afhankelijk van
de hoeveelheid stroom die je op
een kanaal zet. Wanneer het
membraanpotentiaal rond -80
mV zit (ongeveer
rustmembraanpotentiaal), is de kans heel
klein dat er een Na+ of K+ kanaal opengaat.
Hoe positiever het membraanpotentiaal
wordt, hoe waarschijnlijker het wordt dat er
een kanaal opengaat. In de Na+-kanaal grafiek is te zien dat maar zo’n 80% van alle natriumkanalen
opengaat bij een potentiaal van 40 mV. Dit is meer dan genoeg om een actiepotentiaal te kunnen
genereren. Verder is te zien dat bij zowel de Na+ als K+ kanalen 50% open is wanneer het potentiaal -
20 mV is. Natriumkanalen hebben echter een snelle kinetiek, terwijl kaliumkanalen een slome
kinetiek hebben, waardoor de Na+ kanalen eerder opengaan.
