Microscopie
Aantekeningen les week 4
Omkeermicroscoop, hier zitten de lenzen (objectief) eronder. Rechtopstaande microscoop,
hier zit het objectief erboven. Als je een lens wil hebben met een hele hoge numerieke
apparatuur, dan moet je een hele grote sinus hebben (grote hoek), bij een kleine lens is hij
kleiner en daarom is de numerieke apparatuur slecht. Als je van de onderkant kijkt, kan je
grote kweekflessen benaderen, hier heb je een kleinere werkafstand. Alles heeft met de
werkafstand te maken, dit heeft dus weer te maken met de numerieke apparatuur. Hoe beter
de numerieke apparatuur, hoe beter is de resolutie. De resolutie, is de kleinste afstand
waarbij je twee punten gescheiden van elkaar kan zien. De vergroting is dus niet gelijk aan
de resolutie. Hoe kleiner het getal, hoe beter de resolutie. Het verschil tussen een NA van
0.32 en 0.95. 0.32 is een hele goedkope lens.
Lenzen. Achromatische lens, houdt geen rekening met kleur enzo. Apochromatische lens,
maakt gebruikt van meerdere lenzen (lenzen zijn op elkaar geplakt). Hiermee kan je de
intreding en de uittreding perfect regelen. Bij een apochromatische lens komen alle kleuren
er precies zo uit als hoe ze erin zijn gegaan (veel duurdere lens dus).
De formule van de resolutie moet je uit je hoofd weten. De NA = numerieke apparatuur, is de
sinus van de hoek. De n is in welk medium hij zit. Zichtbaar licht (wit licht) bestaat uit alle
kleuren van de regenboog. Wij kunnen deze zien door breking. Dus de brekingsindex van
elke golflengte is net anders. Een lagere golflengte heeft de grootste energie (denk aan dat
UV DNA kapot maakt). Bij fluorescentie gebruiken we verschillende golflengten. Een
lichtmicroscoop noemen we ook wel een absorptie microscoop; de reden hiervoor is
omdat als een preparaat groen is, het preparaat al het andere licht absorbeert.
Fluorescentie microscopie. Bij fluorescentie microscopie gebruiken we geen wit licht, maar
we gebruiken al die deelkleuren (vooral de drie hoofdkleuren, groen, rood en blauw). Er
wordt gebruik gemaakt van deze drie specifieke hoofd kleuren omdat als we deze
lichtkleuren bij elkaar doen, we wit licht krijgen. Als je bij verf die drie kleuren bij elkaar doet
krijg je zwart (complementair aan wit). Als je van een scherm naar een tijdschrift wil, moet je
van RGB, naar andere kleuren.
Fluorescentie microscopie werkt als volgt. De absorptie van licht laat een fluorochrome
molecuul exciteren naar een hogere staat van energie. Het molecuul blijft over een korte
, periode van tijd in de geëxciteerde staat. Als het molecuul terugvalt naar zijn oorspronkelijke
energiestaat, dan straalt hij energie uit (emissie), dit is de fluorescentie. Vanwege de interne
energiedissipatie heeft het uitgestraalde licht altijd een langere golflengte (= lagere energie)
dan het opwindende licht (Stokes-shift). De hoeveelheid emissie licht is in verhouding heel
klein met de hoeveelheid excitatie licht. Rood, groen en blauw, hier horen drie
golflengten bij (die moet je kennen). Een fluorschroom (eiwit of stofje wat kan
fluoresceren), in grondtoestand, gaat naar hogere energie, dan valt hij terug en dan
straalt hij licht uit (emissie). Excitatie is aanstraling en emissie is uitstraling. Excitatie
blauw, dan is je emissie groen. Je emissie is altijd groter dan je excitatie. Hij verliest energie,
dus daarom wordt de golflengte langer. De sprong die hij dan maakt heet stokes-shift.
Dit moet je weten omdat als je een preparaat hebt met groen erin, dan moet je weten dat er
blauw excitatie licht uit moet komen om groen te kunnen zien (dus juiste filter erin zetten). De
kracht van fluorescentie is dat fluorescentie veel gevoeliger is dan absorptie
microscopie, daarnaast kan je veel verschillende kleuren combineren.
Antilichamen herkennen specifieke antigenen. Met de heavy licht regio herkent hij het
antigeen. Monoklonale antilichamen herkennen maar één epitoop en polyklonale
antilichamen herkennen er meerdere op het eiwit. Directe labeling, hierin zit de kleur direct
op het antilichaam, alleen de nadelen zijn dat dit heel erg duur is. Als je een secundair
antilichaam gebruikt dan kan je de verschillende antilichaam kleuren (deze moet dan
specifiek gericht zijn tegen de FC staart). Je kleurt dan dus het tweede antilichaam. Hierbij
heb je een coupe met een antigeen, dan kom je met een primair antilichaam met specifiek
heavy licht regio die het antigeen herkent. FC staart zit erboven (als flag herkenning) en zegt
waar hij in opgewekt is (bijvoorbeeld humaan). Wat je kan doen is die FC staart direct
labelen (heel duur en daarna kan je er niks meer mee). Wat je doet is een secundair
antilichaam ontwikkelen (anti-humaan) en die label je. Dit secundaire antilichaam kan je ook
gebruiken voor andere antilichamen. Nu heb je een groter complex, dus meer signaal (hoe
meer dat je eraan hangt, hoe groter het wordt hoe meer zichtbaar en hoe gevoeliger). Maar
er is wel een probleem als je twee dingen tegelijk wil bekijken (met dus ook een FC staart die
ook humaan is). Als je nu een secundaire antilichaam eraan zet dan bindt hij hier ook aan en
wordt alles groen. Er moet een verschil zijn. Nu moet je gaan kijken naar de subklassen
(verschil in FC staarten). Welke subklassen hebben we (als we naar IgG kijken, hebben we
1, 2A, 2B, 3 en 4). Dan kopen we dus een antilichaam tegen die verschillende subklassen
(als ze uit verschillende subklassen bestaan). Dit betekent dat we nu heel makkelijk
kunnen switchen en dubbel labeling kunnen doen. Dus we kiezen vaak voor die
secundaire antilichamen omdat dit een groot voordeel is.
Als je een incubatie doet met groen en rood, wat heeft dan de beste resolutie? Groen, want
deze heeft een kortere golflengte, betere resolutie (scheidend vermogen). Antilichamen in
fluorescentie hebben nog een heel groot voordeel (rood en groen samenbrengen heb je
geel). Rood, groen en blauw samenbrengen, dan krijg je wit licht. Blauw zit in infrarood
gebied, hoe kan je hem dan blauw brengen? In confocaal zitten fotoreceptoren (foto
multiplier), deze zetten de energie van het rood om naar een grijswaarde signaal en dan kan
je in de computer zeggen dat je die blauw wil hebben. Waarom kies je blauw? Omdat rood,
groen en blauw samen wit zijn. Dus op de afbeelding zie je wit op de plekken waar overal
evenveel van is. Rood en blauw, krijg je magenta, in de overlay krijg je al die co-lokalisatie
beelden. Fluorescentie, is dus excitatie – emissie. Dus als je exciteert met blauw krijg
je groen. De sprong noemen we de stroke shift.
Fluorescentiemicroscoop de opbouw. Er wordt door de HBO/XBO lamp wit licht
aangestraald. Wit licht bevat alle kleuren. Het excitatie filter haalt één kleur licht eruit (dus de
kleur waarmee jij wil aanstralen). Vervolgens heb je de dichroic spiegel, deze reflecteert een
lage golflengte en laat een hogere golflengte door. Tot slot heb je het exmissie filter, deze is
er om nog specifieker af te bakenen dat je echt je groene fluorescentie licht hebt (want er
komt altijd nog een beetje ruis mee).
