HC2, Chapter 5 – DNA replication, repair and recombination
Bacteriën hebben 4*106 nucleotidenparen en mensen 3*109, maar de mutatiesnelheid is bij beiden
hetzelfde (1 substitutie per 1010 nucleotiden per cel generatie). Dit betekent dat bacteriën hun genoom
volledig kunnen repliceren zonder dat er mutaties in voorkomen. Bij mensen zijn 100 kiemcel delingen
nodig om de volgende sperma/eicel te maken, dus elke nakomeling heeft 70 nieuwe mutaties. Veel van
deze mutaties bevinden zich echter wel in niet-essentiële genen, aangezien de eiwit-coderende gebieden
maar een klein deel vormen van het genoom. De mutatiesnelheid limiteert dus de grootte van het genoom
en de hoeveelheid essentiële genen.
De mutatiesnelheid van DNA pol is 1:105, maar wordt verkleind tot 1:1010 door proofreading (1:102) en
mismatch repair (1:103).
De replicatievork
DNA polymerase (III in prokaryoten, α/δ in eukaryoten) zorgt voor de juiste positionering van het
inkomende nucleotide trifosfaat aan de 3’-kant van de sense streng. Hierbij komt pyrofosfaat vrij. Zodra
een nucleotide verkeerd is ingebouwd, kan het DNA polymerase direct via proofreading deze fout
herstellen. DNA polymerase heeft dus een polymeriserende activiteit en een editing activiteit.
DNA polymerase heeft een RNA primer nodig om te kunnen beginnen, gemaakt door primase. RNA wordt
gebruikt omdat ze een andere suiker en ribose hebben die door DNA pol herkend en verwijderd kunnen
worden. De energie om DNA pol te laten bewegen komt van de hydrolyse van nucleotiden (pyrofosfaat).
DNA pol kan alleen nucleotiden inbouwen aan de 3’-OH van 5’→3’. Op deze manier komen er elke keer
nieuwe fosfaten binnen en is proofreading mogelijk. Door van 3’→5’ te synthetiseren zou proofreading
niet mogelijk meer zijn door verlies van de fosfaatgroepen. De RNA primer wordt vervangen voor DNA
door repair polymerases (DNA polymerase I in prokaryoten; DNA polymerase δ in eukaryoten) en de
streng wordt verbonden door DNA ligase.
Verder op de replicatievork zit:
• Clamp loader (ATPase) = brengt de sliding clamp op het DNA (m.b.v. ATP) waardoor DNA
polymerase niet kan loslaten
• Leading strand = continu gesynthetiseerd
• Lagging strand = discontinu gesynthetiseerd (met Okazaki fragmenten)
• Single-strand DNA-binding protein (ssbp) = eiwit dat zorgt dat de DNA streng die is vrijgekomen
via helicase niet gelijk hairpins en loops vormt, maar uitgerekt blijft
• DNA helicase = ontwindt de dsDNA helix (m.b.v. ATP)
Page 1 of 50
,Strand-directed mismatch repair
Als de fout niet herkent wordt door proofreading kan achter met strand-directed mismatch repair het
juiste nucleotide worden ingebouwd. Strand-directed, omdat het specifiek is voor de nieuwe streng. Door
zowel proofreading en mismatch repair, zijn het aantal mutaties tijdens de synthese gehalveerd.
In bacteriën vindt GATC methylatie van de oude streng plaats en nicking (= ssDNA breuk) van de nieuwe
streng. In eukaryoten vindt alleen nicking plaats van de nieuwe streng (deze nick verdwijnt pas als DNA
ligase het dicht). Op deze manieren kan de nieuwe DNA streng herkend worden. Een nick die niet hersteld
wordt door DNA ligase, geeft een fout in de nieuwe streng aan. Het mismatch enzym scant het DNA en
zodra het een nick tegenkomt wordt dit herkend door MutS en geknipt door MutL, waarna er repair DNA
synthese plaatsvindt.
Topoisomerase
Topoisomerase counteracts de ontwinding van het dsDNA veroorzaakt door helicase. Topoisomerase I
zorgt voor deze ontspanning door enkelstrengs te knippen, topoisomerase II door dubbelstrengs te
knippen.
• TI heeft een tyrosine dat covalent kan binden aan 5’ fosfaat van het DNA, en verbreekt zo de
fosfodiester binding in een enkele DNA streng waardoor rotatie plaats kan vinden en de torso
stress verdwijnt. TI kan zichzelf ontkoppelen en de verbinding tussen de 2 nt herstellen. Het
proces kost geen ATP, omdat de energie voor herstel wordt opgeslagen in de fosfotyrosine van TI.
• TII kan 2 strengen van DNA tegelijk doorknippen zonder dat ze van elkaar loskomen, waardoor een
andere DNA streng door het gaatje kan passeren. Het zorgt dus voor het weghalen van lussen en
loops, zodat DNA niet in de knoop raakt. De dsDNA breuk aanmaken kost wel 2 ATP.
Initiatie in prokaryoten
Er is maar 1 origin in het circulaire genoom en dus 2 replicatievorken. Een origin is vaak rijk aan AT nt (2
H-bruggen), aangezien deze makkelijker uit elkaar gehaald kunnen worden dan CG nt (3 H-bruggen). De
origin wordt gebonden door initiator eiwitten, waardoor helicases kunnen worden geladen. Nadat helicase
DNA ontwindt, kan primase initiatie starten. Initiatie vindt plaats zodra er voldoende nutriënten
(omgevingsfactoren) aanwezig zijn om 1 ronde DNA replicatie te voltooien. De origins zijn volledig
gemethyleerd, maar zodra initiatie begint, zijn ze hemi-gemethyleerd (alleen nog de ouderstrengen). In
deze fase zijn de origins ongevoelig voor een nieuwe initiatie. Zodra de origins weer volledig gemethyleerd
zijn (dus ook de dochterstrengen), kunnen ze opnieuw geïnitieerd worden.
Page 2 of 50
,Initiatie in eukaryoten
Eukaryoten repliceren met 50 nt/sec, dit is 10x langzamer dan bij bacteriën, omdat eukaryoten compact
DNA hebben (chromatine, nucleosomen) wat langer duurt om uit elkaar te halen.
Er zijn minimaal 46 origins nodig zodat elke gen een origin heeft, in de praktijk heeft het menselijke genoom
30.000-50.000 bidirectionele origins.
Initiatie begint in de G1 fase waarbij Mcm helicase bindt aan het origin recognition complex (ORC), de
origin met gebonden eiwitten. Zo ontstaat het pre-replicatieve complex. In de S fase worden dit complex
gefosforyleerd. Het helicase wordt zo actief en de ORC zorgt voor de binding van DNA polymerase en
andere replicatie eiwitten, waarna de synthese begint. ORC is inactief door fosforylatie en wordt in de
volgende G1 fase weer actief gemaakt door defosforylatie. In de G2 fase wordt DNA replicatie afgerond.
Nucleosomen
De nucleosomen op het eukaryotisch DNA moeten ook verdubbeld worden. Tijdens de replicatie van DNA
in de S fase worden veel nieuwe histonen gemaakt. Rondom de replicatievork worden de histon octameren
van de nucleosomen gesplitst in één H3-H4 tetrameer en twee H2A-H2B dimeren. De H3-H4 tetrameer
blijft zwakjes verbonden met het DNA en wordt random gedistribueerd naar een van de twee
dochtercomplexen. De H2A-H2B dimeren komen echter compleet los van het DNA.
Nieuw gemaakte H3-H4 tetrameren worden toegevoegd
aan de nieuw gesynthetiseerde DNA om de gaten te
vullen, terwijl de H2A-H2B dimeren (waarvan de helft oud
is en de helft nieuw) random worden toegevoegd om de
nucleosomen af te maken. Hiervoor zijn histon
chaperonnes nodig (chromatine assemblatie factoren).
De chaperonnes worden met hun cargo naar het DNA
gebracht m.b.v. de sliding clamp. Deze clamps blijven lang
genoeg achter op het DNA zodat de chaperonnes hun werk
kunnen afmaken.
Ouderlijke H3-H4 tetrameren worden random
gedistribueerd naar de dochter DNA moleculen, elke
dochter ongeveer evenveel. H2A-H2B dimeren komen
juist los van het DNA zodra de replicatievork passeert. Dit
loskomen begint net voor de replicatievork en wordt
gehandhaafd door chromatine remodelering complexen
die met de vork meebewegen.
Histon chaperonnes NAP1 (voor H2A-H2B) en CAF1 (voor H3-H4) herstellen alle histonen op de
dochtermoleculen door gebruik te maken van zowel de ouderlijke als de nieuw gesynthetiseerde histonen.
De chaperonnes binden losjes aan de sliding clamp en is zo dus gekoppeld aan de replicatie van DNA. De
meeste dochter nucleosomen zijn hybriden van oude en nieuwe histonen, al kunnen sommige ook alleen
oude of nieuwe bevatten.
DNA polymerase δ synthetiseert discontinue de lagging strand, waarbij de lengte van iedere Okazaki
fragment wordt bepaald door de blokkering van DNA polymerase δ door een nieuw gevormde nucleosoom.
In eukaryoten zie je dus vaak een ongeveer gelijke lengte van de Okazaki fragmenten en de nucleosoom
repeat.
Telomerase
De laatste RNA primer gesynthetiseerd op de lagging strand template kan niet worden vervangen voor
DNA omdat er geen 3’-OH eind beschikbaar is voor repair polymerase ➔ end-replication problem.
Bacteriën hebben door hun circulaire DNA dit probleem niet. Eukaryoten hebben bepaalde nucleotide
sequenties aan het einde van de chromosomen, de telomeren. Telomerase herkent het uiteinde van een
bestaande telomeer en verlengt het van 5’→3’ met korte repeats (GGGTTA) door gebruik te maken van
een eigen RNA template. Het is dus een reverse transcriptase.
Page 3 of 50
,Telomeren moeten duidelijk onderscheiden worden, zodat de cel niet de telomeer gaat repareren. Om dit
te voorkomen hebben telomeren:
• Een gespecialiseerde nuclease knipt een stuk van de 5’ eind telomeer, wat bepaalde eiwitten
aantrekt die een beschermende chromosomale kap vormen = shelterin
• Waarschijnlijk worden t-loops gereguleerd door shelterin en geven ook extra bescherming
Somatisch cellen bevatten geen actief telomerase en hebben dus een maximaal aantal delingen (door
telomeren verlies), waarna ze in celdood gaan (replicative cell senescence = ouderdom). Bij kanker is het
telomerase juist actief.
DNA reparatie
DNA wordt continu beschadigd door depurinatie (18.000x per cel/dag) of deaminatie (100x per cel/dag).
Elke chemische verandering leidt tot een abnormale base, dat herkent kan worden. Bij depurinatie vervangt
water de base, bij deaminatie vervangt water de aminogroep. Een uitzondering is de deaminatie van een
methyl-cytosine (gemethyleerde cytosine), wat leidt echter tot een natuurlijke thymine base. Thymine zelf
kan niet gedeamineerd worden, aangezien het geen aminogroep heeft. Deaminatie van cytosine leidt tot
uracil.
Direct reversal of damage
Hierbij wordt de chemische verandering bij DNA schade direct reversed en wordt vooral toegepast bij hoog
mutagene of cytotoxische laesies. Dus bv een methyl groep wordt van de DNA schade overgedragen naar
de repair protein zelf, die vervolgens vernietigd wordt.
Base excision repair
Door deaminatie of depurinatie.
Glycosylases zorgen voor reparatie van individueel beschadigde basen. Ze flippen de basen en als de base
abnormaal is herkennen ze dit en knippen ze het eruit. Een endonuclease en fosfodiesterase verwijderen
vervolgens de suiker fosfaat groep. Zo ontstaat er een nick (ssDNA breuk) die herkent wordt en DNA
polymerase voegt de juiste nucleotide toe en DNA ligase dicht de nick m.b.v. ATP.
Nucleotide excision repair
Door UV licht, induceert thymide/pyrimidine dimeren.
Kunnen niet door glycosylases worden verwijderd omdat er 2 basen bij zijn betrokken. Een excision
nuclease herkent en knipt het beschadigde deel eruit. DNA helicase helpt bij het verwijderen. DNA
polymerase en ligase zorgen voor herstel.
Nucleotide excision repair is gekoppeld aan transcriptie.
Translesion DNA polymerase
Repliceert zwaar beschadigd DNA. Zodra DNA polymerase bv een dimeer tegenkomt tijdens replicatie, valt
het eraf en wordt de sliding clamp gemarkeerd via ubiquitinering. Translesion DNA polymerase herkent
dit en kan de dimeer gewoon aflezen, ten koste van de precisie (hoge kans op mutaties). Vervolgens kan
DNA polymerase weer verder gaan. Op deze manier blijft de synthese doorlopen en kan de fout later
hersteld worden.
Page 4 of 50
, Nonhomologous end joining
Repareert snel dsDNA breuken. De blunt ends worden herkend door Ku heterodimeren, deze kijken niet
naar sequenties maar koppelen gewoon 2 uiteinden aan elkaar. Vervolgens vindt ligatie plaats. Het is snel,
maar vaak hou je een mutatie over (je mist nucleotiden of je hebt teveel). Dit is niet erg als het niet
coderend DNA is.
Als NHEJ niet wordt toegepast op juiste uiteinden, kunnen 2 verschillende chromosomen aan elkaar
gekoppeld worden (translocaties).
Homologe recombinatie
1) Repareert heel precies dsDNA breuken
2) Herstelt geblokkeerde replicatievorken (door bv een nick)
3) Zorgt voor recombinatie tijdens de meiose (ook
door een dsDNA breuk, maar nu zelf geïnduceerd)
De reparaties gebeuren vaak in de S of G2 fase (2 kopieën).
Het gebruikt een kopie van het al gerepliceerde DNA om de
ander te repareren. Bij gebruik homologe chromosomen
leidt het namelijk tot een verlies in heterozygositeit.
Teveel of te weinig homologe recombinatie leidt tot kanker.
Page 5 of 50
