Hfst 5, DNA replicatie, repair en recombinatie
Inleiding
Evolutie, hoewel de korte termijn overleving van een cel afhankelijk is van het voorkomen van
veranderingen in zijn DNA, is het voor de lange termijn overleving van een soort van belang dat DNA
sequenties veranderlijk zijn over meerdere generaties. Dit maakt evolutionaire adaptaties mogelijk.
5.1 het behoud van DNA sequenties
Mutatie, is een permanente verandering in de DNA sequentie.
Silent mutatie, veel mutaties zijn silent wat wil zeggen dat ze geen effect hebben. Denk hierbij aan
een codon dat verandert, maar nog steeds voor hetzelfde aminozuur codeert.
Kiemcellen, je wilt voorkomen dat er mutaties optreden in sperma- of eicellen. Hiervoor zijn allerlei
mechanismen aanwezig die hieronder beschreven staan. Desondanks dat de mutatiefrequentie heel
laag is, is berekend dat het maximaal aantal essentiële eiwitten om te overleven niet hoger mag zijn
dan 30.000 voor een organisme. Dan wordt de kans namelijk te groot dat een kritisch component
gemuteerd raakt.
Somatische cellen, niet alleen kiemcellen moeten beschermd worden tegen mutaties. Als er teveel
mutaties ophopen in somatische cellen kunnen er bijvoorbeeld tumoren ontstaan.
Mutation rate, de mutatiegraad ligt voor zowel bacteriën als de mens rond 1 nucleotide verandering
per 1010 nucleotiden elke keer dat DNA repliceert.
5.2 DNA replicatie mechanismen
DNA templating, cellen kopiëren de sequentie van een DNA
streng door de andere als template te gebruiken.
DNA polymerase, is een nucleotide-polymeriserend enzym
dat vrije nucleotiden als substraat gebruikt. Om precies te
zijn, gebruikt het enzym deoxyribonucleoside trifosfaten.
Rechts zie je een nieuwe nucleotide gepolymeriseerd worden.
Semiconservatief, de DNA dubbele helix wordt
semiconservatief genoemd, aangezien replicatie 2 nieuwe
helices oplevert die bestaan uit 1 oude én 1 nieuwe streng.
Replicatie vork, bij DNA replicatie is sprake van een replicatie vork die zich over de parental dubbele
helix verplaatst. Hierin is een multi-enzym complex aanwezig dat o.a. DNA polymerase bevat. Je ziet
hierboven dat 1 v/d 2 dochterstrengen op een continue wijze wordt aangemaakt, terwijl de andere in
stukjes (genaamd Okazaki fragmenten) wordt geproduceerd. Dit komt door de antiparallele
oriëntatie van DNA en het feit dat DNA polymerase enkel in de 5’ naar 3’ richting polymeriseert.
Leading strand, de dochterstreng die op continue wijze wordt aangemaakt.
Lagging strand, de dochterstreng die in Okazaki fragmenten wordt aangemaakt.
Precisie, zoals al voorbij is gekomen is de betrouwbaarheid van DNA replicatie zo hoog dat maar 1 op
de 1010 nucleotiden verkeerd wordt gerepliceerd. Op basis van complementaire basisparing alleen
, zou deze precisie veel lager zijn (1 op 104 of 105). Er komen dan ook nog andere
zaken bij kijken: DNA polymerase proofreading en strand-directed mismatch repair.
Hier kom ik nog op terug.
Proofreading, DNA polymerase doet aan proofreading wat inhoudt dat het enzym
een verkeerd nucleotide kan herstellen. DNA polymerase voert de 1e proofreading
stap net uit voordat een nieuw nucleotide covalent toegevoegd wordt aan de
groeiende streng. Het correcte nucleotide heeft een hogere affiniteit voor het
polymerase, aangezien de juiste paring energetisch voordeliger is. Daarnaast checkt
het enzym nog een keer of die het juist nucleotide heeft als die het nucleotide
gebonden heeft maar nog niet covalent verbonden heeft. Het enzym moet namelijk
een conformatie verandering aangaan om zijn grip te versterken. Deze verandering
verloopt makkelijker met het juiste nucleotide en is dus een ‘double check’.
Incorrecte nucleotiden zijn moeilijker toe te voegen en hebben dus een grotere kans
weg te diffunderen voordat polymerase ze verkeerd toe kan voegen.
Exonucleolytic proofreading, is een andere corrigerende reactie die meteen
plaatsvindt nadat een verkeerd nucleotide covalent gebonden is. DNA polymerases
voegen alleen nucleotide toe aan het 3’-OH uiteinde van een primer streng. DNA
moleculen met een mismatched nucleotide 3’-OH einde kunnen niet effectief als
templates gebruikt worden, aangezien dit veel moeilijker is. DNA polymerases
bezitten een aparte katalytische site, genaamd 3’-to-5’ proofreading exonuclease, die
een ongepaard of verkeerd gepaard residu van de primer terminus kunnen klieven.
Dit wordt gedaan tot er een correct 3’-OH over is die dan weer als primer kan dienen
voor verdere DNA synthese. Dit is rechts weergegeven.
DNA VS RNA polymerase, waar DNA polymerase een perfecte gebasepaarde primer
terminus nodig heeft en niet de novo kan beginnen met synthese, geldt dat niet voor
RNA polymerase. RNA polymerase heeft dan ook geen exonucleolytic proofreading
mechanisme nodig. Fouten in RNA worden niet aan de volgende generatie
overgedragen. Door het ontbreken van dit mechanisme kan RNA polymerase zonder
primer aan RNA synthese beginnen.
Richting DNA polymerase, door zijn exonucleolytic proofreading mechanisme is DNA polymerase niet
in staat in de 3’ naar 5’ richting DNA te polymeriseren. Het 5’ einde moet namelijk de energie leveren
om DNA synthese uit te kunnen voeren, maar als een verkeerd ingebouwd nucleotide dan verwijderd
wordt is er geen trifosfaat meer aanwezig om energie te leveren, aangezien de fosfaatgroepen bij het
inbouwen van het verkeerde nucleotide al gehydroliseerd zijn.
DNA primase, maakt de primers die nodig zijn voor synthese van de lagging strand en
ook die ene primer die nodig is voor de leading strand. Dit enzym gebruikt
ribonucleoside trifosfaten om een korte RNA primer te synthetiseren. Je hebt dus
tijdelijk stukjes DNA-RNA hybride dubbele helix. De RNA primer bevat een 3’-OH einde
waar DNA polymerase op kan voortborduren. Wanneer DNA polymerase de RNA
primer van een opvolgend Okazaki fragment tegenkomt, stopt het. Een DNA repair
systeem zorgt er dan voor dat
de RNA primer ertussenuit
gehaald wordt en vervangen
wordt voor DNA.
DNA ligase (→), kan het 3’
einde van het ene DNA fragment aan het 5’ uiteinde van het opvolgende fragment
binden en dit vindt dus plaats om Okazaki fragmenten te verbinden. Hiervoor gebruikt
het enzym ATP om het 5’ uiteinde te ‘activeren’.
DNA helicase (), DNA is erg stabiel onder fysiologische omstandigheden en je hebt
dus een enzym nodig om uit elkaar te halen en ruimte te maken voor de replicatie
vork. Dit enzym is helicase. Door ATP te hydrolyseren verandert dit enzym op een
cyclische wijze van conformatie wat hem in staat stelt mechanisch werk te verrichten.
