Lukas Kapitein 07-02-2020
HCO4, using light to dissect and direct transport inside neurons
Neuron, rechts zie je een neuron en die is belangrijk voor signaaltransductie
(ontvangen, verwerken en doorsturen van signalen). Het begin van de axon, het
initial segment, is waar de actiepotentialen ontstaan en hier zijn veel natriumkanalen
aanwezig. Of er een actiepotentiaal ontstaat is afhankelijk van alle signalen die
worden ontvangen in dendrieten (integratie). Alle stippjes langs de blauwe dingen
zijn excitatoir en dan heb je ook nog inhibitoire synapsen, waardoor sprake is van
summatie. Neuronen versturen dus niet alleen signalen, maar verwerken ze ook. Om
dit mogelijk te maken heb je invoer, verwerking en uitvoer nodig. De invoer verloopt
langs de dendriet en uitvoer langs de axon. Deze structuren hebben hele andere
functies en moeten dus ook andere eiwitten etc. hebben. Dit verschil in moleculaire
compositie en structuur wordt beschreven als polariteit. Een neuron is het meest extreme geval van
een polaire cel. Desondanks dat we veel verschillende neuronen hebben, zijn de dendrieten altijd
ongeveer even lang en hebben ze altijd 3 à 4 vertakkingen. Axonen kunnen wel heel erg verschillen.
Zo hebben we axonen die maar liefst 1 meter lang kunnen zijn. Verder zijn axonen veel gladder en
vertakken ze meer, maar ook op een andere manier dan dendrieten. Elke axon vertakking staat
loodrecht op de hoofd axon en wordt helemaal niet veel dunner. Dat komt dus doordat er andere
eiwitten aanwezig zijn en andere processen plaatsvinden. Met name het cytoskelet is anders
georganiseerd. Om de vorm van een cel te onderzoeken, moet je altijd naar het cytoskelet kijken. De
uitstulpingen zijn hele fijne structuren dus je weet al dat deze vol zitten met actine. Voor
vertakkingen en de langere uitlopers heb je echter ook microtubuli nodig. Microtubuli zijn essentieel
voor het robuuste transport van alle bouwstoffen in een uitloper/neuriet.
Polariteit, als je een gepolariseerde cel hebt, heb je ook gepolariseerd transport nodig.
Spatiële biologie, bepaalde blaasjes moet naar de ene kant van de cel en
andere blaasjes weer naar de andere kant. Niet alleen blaasjes maar ook
eiwitten moeten naar dendrieten of axonen. Als dat niet goed gereguleerd
wordt, krijg je in de axon receptoren die signalen kunnen ontvangen wat dan
zou interferen met het actiepotentiaal. Je moet dus controle hebben over wat
naar het axon gaat en wat niet, maar ook binnen deze structuren moeten
organellen op de juiste plek zitten. Op de spines heb je excitatoire synapsen met
glutamaat receptoren die daar komen middels exocytose en soms moeten ze
ook weggehaald worden (plasticiteit). Deze receptoren worden middels
recycling endosomen geïnternaliseerd en gesecreteerd, vandaar dat recycling
endosomen verrijkt zijn in dendritische spines. Verder zie je in growht cones ook
veel endosomen, doordat je voor groei extra lipiden nodig hebt en die kunnen
dan middels endosomen die fuseren toegevoegd worden. Daarnaast zie je in de afbeelding ook nog
andere organellen weergegeven. In de dendriet heb je overal ER, maar het golgi apparaat zit enkel in
het cellichaam. Eiwitten die in het ER gemaakt worden gaan normaal echter naar het golgi om verder
gemodificeerd te worden. Het zou nogal onnozel zijn om een eiwit aan het einde van een dendriet of
axon terug te sturen naar het cellichaam en dat gebeurt dan ook niet. Er zijn heel van canonical
routes waarbij eiwitten direct van het ER naar het plasmamembraan gaan en dus minder
gemodificeerd zijn. Het kan ook middels golgi ‘outposts’ gebeuren die in dendrieten aanwezig zijn.
Deze outposts moeten dus ook weer gepositioneerd worden.
Transport is dus belangrijk voor axon VS dendriet transport, maar ook om bepaalde zaken lokaal op
de juiste plek te krijgen. Vragen die ze in Utrecht willen beantwoorden is hoe de organellen nu precies
getransporteerd en gepostioneerd worden en wat dan de site-specific functies zijn van de
verschillende organellen.
Motoreiwitten, we hebben 3 motoreiwitten. Kinesine loopt over microtubuli naar het
plus einde, dyneïne loopt over microtubuli naar het min einde en myosine loopt over
actine naar het plus einde (met name myosine 5 en 6).
, Lukas Kapitein 07-02-2020
Redundancy, met name bij de kinesine familie heb je veel verschillende motoreiwitten die aan
transport doen. Als je dan kinesine gemedieerd transport uit wil schakelen, zul je dus meerdere
genen moeten uitschakelen.
Onbekend motoreiwitten, we weten veel over de biofysische eigenschappen van motoreiwitten
door zuivering en in vitro reconstitutie studies. We weten dus hoe ze op moleculair niveau
functioneren, maar we weten eigenlijk niet zo goed wat ze nu precies in een cel doen. Daarnaast is
ook nog niet veel bekend over de interplay tussen verschillende motoren. Reguleren ze elkaars
activiteit of gaan ze als het ware touwtrekken als ze op hetzelfde blaasje zitten? Tot slot heb je nog
microtubuli heterogeniteit. Niet elke microtubuli is hetzelfde en dat is in vitro heel moeilijk te
reconstitueren. Als je weet welke enzymen microtubuli modificaties in stand brengen, kan je deze
toevoegen en kijken wat er gebeurt. Resultaten van deze modificaties zijn in vitro echter
teleurstellend, want je ziet weinig verschil. Desondanks weten we dat sommige kinesines enkel over
gemodificeerde microtubuli heen lopen en we hebben dus nog te weinig informatie om de cel na te
bootsen.
Doel, er zijn heel veel aanwijzingen dat het verschil in microtubuli een belangrijke rol speelt in
selectief transport en het is dus belangrijk om dit goed te begrijpen. Hiervoor kan niet enkel gebruik
gemaakt worden van in vitro assays. De doelen van het lab in Utrecht zijn dus als volgt:
- Motor activiteit begrijpen op het native cellulaire cytoskelet.
1. Dit vereist dat we meer inzicht krijgen in in het cellulaire cytoskelet.
2. Hiervoor moeten we specifieke bepaalde motoreiwitten kunnen testen. We moeten
dus goed gecontroleerde intracellulaire transport assays hebben.
- De spatiële rollen van verschillende organellen begrijpen.
3. Hiervoor moeten we goed gecontroleerde assays hebben voor organel positionering.
Om het in een analogie te vertellen willen we dus de kaart vinden (1), de verkeersregels vinden (2) en
de verkeerscontrole begrijpen (3).
Intracellulaire transport assay, als je organellen zuivert en biochemie doet, vind je dat de meeste
organellen meerdere motoren hebben. Dat maakt het moeilijk om te achterhalen welke motor nu
precies actief is. In axonen liggen alle microtubuli met hun plus einde naar buiten. Je weet dus dat je
met een plus einde gerichte motor te maken hebt als iets naar de periferie beweegt en met een min
einde gerichte motor als je iets richting de kern ziet gaan (dyneïne I). In dendrieten is dit een stuk
lastiger, want daar heb je met een gemixte oriëntatie te maken: ongeveer de helft van de microtubuli
ligt met zijn min einde naar de buiten en de andere helft met zijn plus einde. Dit maakt het eigenlijk
onmogelijk om transport naar binnen of buiten te sturen. Als je een blaasje eerst naar buiten ziet
lopen en vervolgens naar binnen, kan je dus niet zeggen dat dyneïne de rol over heeft genomen van
kinesine, want de kans is aanwezig dat het blaasje op een andere microtubuli terecht is gekomen.
Een oplossing voor dit probleem is om specifieke motoreiwitten te koppelen aan organellen die
normaal gesproken niet getransporteerd worden. Als je het voor elkaar krijgt om met een bepaalde
stimulus te zorgen dat Kif5b bijvoorbeeld aan een stilstaand organel bindt, weet je dat de beweging
die je ziet waarschijnlijk te danken is aan Kif5b. Het zou kunnen dat Kif5b altijd een complex vormt
met dyneïne en dan ben je weer terug bij af. Je moet dus goed nadenken wat je precies rekruteert.
FRB & FKBP, we zijn in staat motoreiwitten aan organellen te koppelen door gebruik
te maken van FKBP en FRB. Dit zijn twee eiwitten die sterk aan elkaar binden als je
rapalog toevoegt. Het mooie aan deze binding is dat enkel FKBP en FRB aan elkaar
zullen binden bij toevoeging van rapalog, waardoor je geen endogene processen
verstoord. Door motoreiwitten op juiste manier te trunceren kunnen ze zelf niet
meer binden aan cargo, maar kunnen ze nog wel lopen. Door deze motoreiwitten te
fuseren met FRB en FKBP aan peroxisomen te zetten heb je een mooie assay.
Peroxisomen bewegen normaal gesproken niet heel veel en met deze assay kan je
dus goed de functie van je betreffende motoreiwit onderzoeken. Als je FRB koppelt
aan kinesine-2 zal je zonder toevoeging van rapalog zien dat de peroxisomen zich
vooral in het centrum van een cel bevinden die zijn centrosoom in het midden heeft
zitten en als je dan rapalog toevoegt, zal je zien dat de blaasjes zich naar de periferie verplaatsen
