HC10 Why electron microscopy?
In 1933 is de eerste elektronen microscoop (EM) gebouwd, hierbij werd gedacht dat deze niet
compatibel was met leven. Cryo EM heeft hier echter verandering in gebracht, maar de historie van
EM is veel korter dan die van licht microscopie (1550), waardoor de lenzen bijvoorbeeld nog niet
geoptimaliseerd zijn.
Een EM is een duur instrument. Ze kosten grofweg €10,- per eV aan energie in de elektronen beam,
en de beam energieën rijken van 100,000 tot 400,000 eV. Deze microscopen verhogen de haalbare
resolutie, met een bereik van 100 μm tot 1 Ångström, waar een lichtmicroscoop maar van 1 cm tot 1
μm kan komen. Zo zijn er met een EM een brede range van karakterisering technieken mogelijk met
hoge spatiele en analytische resolutie, dus over de vorm en de elementen waaruit het sample
bestaat.
Eer zijn veel groepen die behoefte hebben aan een EM
- Aardwetenschappen
- Material science
- Industrial manufacturing
- Forensische wetenschap
- Biomedische wetenschappen
- Cel biologen
- Structurele biologen
Belangrijke overeenkomsten tussen een LM en EM zijn in de afbeelding te zien
o In een EM zit geen oog stuk, het beeld wordt door een camera opgevangen
Er zijn wel belangrijke verschillen
- Fotonen zijn in een EM vervangen door elektronen
- Glazen lenzen zijn in een EM vervangen voor elektromagnetische en elektrostatische lenzen
- Het signaal dat wordt opgevangen is kleurloos
- Met een EM kan je een 1.000.000x hogere vergroting krijgen
- Met een EM heb je een kleinere field of view
1
,Hoge vergroting en hoge resolutie
- Een EM heeft zowel een hoge vergroting als een hoge resolutie. Van deze twee is de hoge
resolutie belangrijker omdat dit het mogelijk maakt om twee dicht bij elkaar zittende punt
bronnen van elkaar te kunnen onderscheiden. De vergroting zegt alleen iets over hoever je
een afbeelding kan vergroten.
Soorten EMs
- Transmissie Elektron Microscoop (TEM)
o Wordt gebruikt om dóór een sample heen te kijken, hiervoor
moeten de elektronen dóór het sample vallen
- Scanning Elektron Microscoop (SEM)
o Scant over het oppervlak van een sample, dus elektronen gaan
niet door het sample heen. Hier door krijg je mooie
afbeeldingen.
Foton energie
- Energie en golflengte hebben een reciproke relatie; een
grotere golflengte betekent een lagere energie en
andersom.
o h is de constante van Planck
o c is de lichtsnelheid
Waarom elektronen gebruikt worden voor imaging
- Aan de hand van Abbe’s formule is te zien dat het diffractie limiet afhankelijk is van de
numerieke apertuur en de golflengte van de lichtbron. Met olie is het mogelijk om de NA te
vergroten, maar nog steeds niet groot genoeg om intracellulair naar structuren te kunnen
kijken. Om deze reden moet de golflengte dus verkleind worden.
o Wilhelm Röntgens X-ray (10 nm - 10 pm)
Heeft X-ray uitgevonden, waarmee hij afbeeldingen heeft gemaakt van bv de
hand van zijn vrouw. Er zijn echter maar weinig X-ray microscopen omdat het
een erg schadelijke vorm van straling is door hun hoge energie. X-ray
beweegt door ruimte op dezelfde manier als zichtbaar licht, beide zijn een
vorm van elektromagnetische golven, maar door de hogere energie is er een
grote kans dat ze atomen ioniseren en dus schadelijk zijn voor levend
weefsel.
Door deze hoge energie gaan ze wel makkelijker door dikke samples, en
worden ze geabsorbeerd zonder veel van richting te veranderen.
Ze zijn dus moeilijker om van richting te veranderen met
bijvoorbeeld een spiegel, waardoor ze niet makkelijk te gebruiken
zijn in lens systemen, waar veel gebruik wordt gemaakt van spiegels.
o Gamma straling
Kunnen nog dikkere samples penetreren, maar hebben ook een nog hogere
energie dan X-ray waardoor ze nog schadelijker zijn voor levend weefsels
Zijn ook moeilijk om richting te geven of te reflecteren door lenzen en
spiegels
- We zitten dus een beetje vast op zichtbaar licht in het elektromagnetische spectrum. Dit zijn
namelijk fotonen en deze bewegen met de lichtsnelheid. De oplossing is om gebruik te
2
, maken van elektronen, hierbij kan je namelijk de snelheid veranderen waardoor de
lichtsnelheid geen limiterende factor meer is.
o Elektronen zijn ontdekt in 1897 en hebben, anders dan fotonen, een massa en
lading, wat de manier waarop elektronen een interactie met een stof aangaan
beïnvloedt. Er is echter een overeenkomst in dat ze beide deeltjes en golf
eigenschappen hebben
Louis De Broglie liet zien hoe deeltjes en golf karakteristieken met elkaar in
verband staan door een verband te laten zien tussen golflengte en snelheid.
Elk deeltje met een momentum;
snelheid x massa, heeft een
golflengte.
Elektronen hebben een lage massa,
maar door de snelheid te veranderen kunnen we de golflengte bepalen. Dit
wordt gedaan door gebruik te maken van een potentiaal drop, U acc, wat zorgt
een potentiale energie eUacc,
e staat voor de lading van een elektron (= 1.602 x10 -19 Coulomb)
Potentiale energie is gelijk aan kinetische energie
o Dus om de golflengte te bepalen worden elektronen onder een
bepaalde potentiele energie gezet. Hierdoor zullen ze versnellen tot
een bepaalde snelheid die te berekenen is met bovenstaande formule. Aan de hand
van deze snelheid is vervolgens de golflengte van de elektronen te berekenen.
Niet relativistische elektron golflengtes <100kV
Wanneer de elektronsnelheid lager is
dan de halve lichtsnelheid
Relativistische elektron golflengtes >100kV
o In een SEM wordt gebruik gemaakt van 10 keV,
hierbij zal dus de niet-relativistische formule worden
gebruikt en zal een theoretische golflengte van 12 pm
berekend worden, hiermee is het al mogelijk om
atomen te onderscheiden.
o In een TEM wordt 200 keV gebruikt waardoor de
relativistische formule toegepast wordt, en een
theoretische golflengte van 2.5 pm wordt berekend.
o X-ray gebruikt energie in dezelfde orde als SEM, maar
omdat je gebruik maakt van de lichtsnelheid zal de
theoretische golflengte groter zijn dan in SEM
- In werkelijkheid krijgen we niet zulke goede golflengtes
doordat de lenzen nog niet perfect zijn. Toch krijg je een veel kleinere golflengte dan met LM
en wordt atomische resolutie bereikt (200 kV TEM geeft resolutie van 50 pm).
- Om dus kortere golflengtes te krijgen met de microscoop, veranderen we het
versnellingsvoltage van de microscoop. Het is ook mogelijk om een 200 kV microscoop met
80 kV te gebruiken, zo kan je bijvoorbeeld een grotere golflengte bereiken.
Nadelen van gebruik van elektronen voor imaging
- Elektronen zijn ook een vorm van ioniserende straling, een straling die stevig vastzittende
elektronen uit de binnenste schil van een atoom kan halen door de energie over te geven
aan individuele atomen in het sample.
- Dit resulteert in beam schade
3
, o Knock-out van target atomen
o Verstoren van moleculaire bindingen
o Vorming van hitte wat resulteert in gaten, sublimatie en vervormingen
- Veiligheidsoverwegingen zijn dat er X-ray gevormd kan worden, daarom mag je nooit zelf de
microscoop aanpassen of er zelf een bouwen, zoals je bij een lichtmicroscoop wel kan doen.
- Sampling moeilijkheden
o Bij een EM kijk je naar een heel klein deel van een sample, hierdoor weet je niet of
de image die je ziet het sample wel goed representeert. Je moet dus goed kijken of
hetgeen je ziet, wel representatief is.
o Ook moet je goed letten op de interpretatie, je maakt namelijk een 2D beeld van een
3D sample. Zo kan het zijn dat de informatie in het 2D beeld een geheel lijkt te zijn,
terwijl dit eigenlijk een overlap is van twee structuren in 3D. Onze ogen zijn niet
gewend aan het interpreteren van EM beelden, terwijl dit in het geval van LM
makkelijker is. Om deze reden is er goede training nodig voor het interpreteren van
afbeeldingen met de EM.
o Het sample moet ook erg dun zijn voor EM
EM optische aberraties
- Chromatische aberratie (Cc)
o De beam is niet mono-energetisch wat leidt tot variatie in golflengte
∆λ: coherentie lengte
- Sferische aberraties (Cs)
o Imperfecte beam optica (magnetische lenzen) leidt tot verschillende verstoringen
Coma abaratie
Lichtbron die niet-paralel van de optische as op
de lens valt, vormt een komeetvormig beeld
doordat elk punt op een andere hoogte wordt
afgebeeld.
Astigmatisme
In het geval van een astigmatisme wordt het
ligt dat propageert in twee loodrechte
vlakken, op verschillende punten
gefocusseerd.
Dit gebeurt in het geval van een niet-perfecte,
ovale lens. Het is namelijk mogelijk dat het
verticale licht met een andere curvatuur de lens binnenvalt dan het
horizontale licht, waardoor het ook anders gebogen de lens weer uit
zal komen.
HC11 The electron microscope
Er zijn verschillende onderdelen nodig om een EM te bouwen;
1. Een vacuum systeem
o Alle EMs werken onder vacuum. TEMs worden permanent onder
vacuum gehouden, tenzij ze gerepareerd worden. Toegang tot
het binnensysteem van de column gaat via een airlock systeem,
welke apart gepompt kan worden. De reden hiervoor is alsvolgt:
4
