Hoofdstuk 3 - Kanker als infectieziekte
Het is lang onduidelijk gebleven hoe kanker ontstaat. Vroege aanwijzingen wezen op
omgevingsfactoren en kanker als een infectieziekte.
RNA tumor-virussen kunnen cellen in kweek transformeren tot cellen met eigenschappen
van kanker:
● Verandering in morfologie (ronde vorm/foci)
● Verlies van contact-inhibitie (stapelen op elkaar en groeien door elkaar)
● Kunnen groeien zonder contact met de ondergrond (anchorage independent
growth)
○ Normaal gesproken gaan cellen dood door anoikis als ze niet hechten op
een ondergrond (ECM)
○ Kankercellen kunnen klonteren in soft-agarose of methylcellulose medium
en wel doorgroeien zonder aan de ondergrond te hechten
● Immortalisatie (oneindig prolifereren)
● Verlies van afhankelijkheid van mitogene groeifactoren
● Verhoogde saturatie dichtheid
● Kunnen stoppen met prolifereren bij verlies van groeifactoren
● Meer glucosetransport door verhoogd metabolisme
Transformatie door RSV is temperatuurgevoelig. Bij de permissieve temperatuur kan
RSV transformeren (dit is reversibel). Bij een non-permissieve temperatuur vindt er
namelijk weer een verandering van celmorfologie plaats naar de oude vorm.
RSV is een retrovirus, een type RNA tumor-virus. RNA-virussen maken altijd gebruik van
de lysogene cyclus, waarbij ze integreren in het genoom van de gastheer. Retrovirussen
zoals RSV hebben een bijzondere levenscyclus:
1. RSV bindt met zijn envelopeiwitten aan receptoren op de gastheercel. Na binding
wordt het virus via endocytose of fusie in de cel opgenomen.
2. Eenmaal in het cytoplasma breekt de capside open door uncoating. Hierdoor
komen reverse-transcriptase en integrase vrij.
3. Door reverse-transcriptase wordt van het virale RNA een complementaire DNA
(-DNA) streng gemaakt. Het originele virale RNA wordt afgebroken en er wordt een
complementaire DNA (+DNA) streng gemaakt, waardoor dsDNA ontstaat uit ssRNA.
4. Dit dsDNA integreert door integrase als een provirus willekeurig in het genoom van
de gastheercel. Als provirus is het virale DNA stabiel en wordt het bij elke celdeling
meegekopieerd in het genoom van de dochtercellen.
5. Het provirus wordt door RNA-polymerase II van de gastheer afgeschreven in virale
RNA-kopieën of mRNA’s die coderen voor virale eiwitten.
6. De nieuw geproduceerde virale componenten worden geassembleerd tot nieuwe
virions onder het celmembraan van de gastheer.
7. Via budding worden de nieuwe virions vrijgelaten van de gastheercel. Een stukje
van het celmembraan gaat mee en vormt de virale envelop met eiwitten die nodig
zijn om nieuwe cellen te infecteren.
8. De gastheercel blijft leven (in tegenstelling tot de lytische cyclus, waarbij de cellen
lyseren en doodgaan als gevolg van virale infectie).
,RSV codeert voor 4 essentiële
genen die bijdragen aan kanker:
1. gag: codeert voor structurele
kerncomponenten
2. pol: codeert voor reverse
transcriptase en integrase
3. env: codeert voor eiwitten
voor de virale envelop
(glycoproteïne-spikes)
4. src: oncogen dat
verantwoordelijk is voor de
celtransformatie
Wanneer RSV in een cel komt, vindt
er uncoating plaats van het virale
RNA/DNA. In de nucleus gebruikt
het virus dan de cellulaire RNA/DNA polymerase om transcriptie (RNA) of replicatie (DNA) te
induceren. Het getranscribeerde RNA wordt getransleerd tot virale eiwitten door cellulaire
ribosomen en het gerepliceerde progene DNA wordt in virale eiwitten verpakt. De virale
eiwitten worden in de extracellulaire matrix vrijgelaten om volgende cellen te infecteren. In
plaats van dat de cellen doodgaan, kan soms kanker ontstaan.
RSV is sterk verwant aan ALV (een virus dat geen kanker kan veroorzaken).
Het src gen dat alleen RSV heeft, bleek verantwoordelijk te zijn voor celtransformatie
(proto-oncogen). Dit is ontdekt door een experiment:
● Cel die wel en cel die niet is geïnfecteerd met RSV werden toegediend met een
DNA-radioactieve probe die al het geïsoleerde DNA kleurt.
● Het overeenkomstig DNA tussen de cellen hybridiseert en wordt dubbelstrengs.
● Al het dubbelstrengs DNA wordt afgebroken, alleen src (alleen aanwezig bij
geïnfecteerde cel) blijft over.
Een ander experiment toonde aan dat src essentieel is en verantwoordelijk voor de
celtransformatie:
● RNA wordt geïsoleerd uit wildtype RSV (met src-gen)
● Van dit RNA wordt via reverse transcriptie complementair DNA (cDNA) gemaakt,
wat wordt gelabeld met een radioactieve probe zodat het detecteerbaar is
● DNA/RNA wordt geïsoleerd uit mutant RSV (zonder src-gen)
● De probe (gelabeld cDNA) kan niet binden met het mutant-RNA/-DNA en blijft over,
deze probe kan nu worden gebruikt om src te zoeken in andere monsters
● Src is sterk verwant aan een normaal geconserveerd gen in verschillende
diersoorten
Waarschijnlijk heeft een ALV virusdeeltje waarschijnlijk zijn dsDNA ingebouwd in het
genoom van de gastheer naast het src gen, en is bij het afschrijven dit src-gen per ongeluk
meegekomen waardoor RSV is ontstaan.
Dit is een voorbeeld van een acuut transformerend retrovirus. Deze hebben een cellulair
proto-oncogen (c-onc) ingebouwd. De ontregelde expressie hiervan is verantwoordelijk voor
de celtransformatie en tumorvorming. Andere cellulaire oncogenen die zo zijn ontdekt zijn
myc, erbB, H-Ras.
,Langzaam transformerende retrovirussen (zoals ALV) hebben geen oncogen ingebouwd,
maar kunnen incidenteel cellen transformeren door insertiemutagenese:
● Integratie in het genoom via reverse transcriptase en integrase op een random plek
● Als dit dicht bij een cellulair proto-oncogen gebeurt (zoals c-myc), kan de sterke
virale promotor de expressie hiervan verhogen. Soms kan er ook een
tumorsuppressorgen geïnactiveerd worden
● Dit duurt langer dan acute transformatie omdat de integratie van het provirus op een
specifieke plek in het genoom op toeval berust.
Andere cellulaire oncogenen die zo zijn ontdekt zijn myc, int-1/wnt, p53, K-Ras.
HTLV-1 is een ander retrovirus dat op een andere manier kanker kan induceren:
● Het bevat geen viraal oncogen, maar een intrinsiek viraal gen (tax) dat in
gastheercellen proliferatie van T-cellen stimuleert en apoptose inhibeert.
● Dit kan leiden tot adult T-cell leukemia (ATL).
Naast RNA tumor-virussen zijn er ook klassen van DNA-tumor-virussen, zoals HPV, SV40,
adenovirussen, hepadna (HBV), papilloma (HPV/SPV) en herpesviruses die kanker
kunnen veroorzaken. Bij DNA-tumorvirussen gaat normaal gesproken na vermenigvuldiging
van het virus de cel dood (lytische cyclus). In zeldzame situaties, in niet-permissieve
cellen, kan het virus zich toch integreren in de cel en tot transformatie leiden. Er zijn vaak
maar 1 of 2 genen van het virale DNA nodig voor deze transformatie, die betrokken zijn bij
het inactiveren van tumorsuppressorgenen van de gastheercel, of het ontregelen van de
celcyclus controle van de gastheercel:
● SV40: Large T wordt ingebouwd in het genoom van de gastheer
○ Large-T antigen bindt aan tumor suppressor eiwitten (Rb en p53) waardoor
celgroei niet gecontroleerd kan worden en kankercellen ontstaan.
● Adenovirus: E1A en E1B worden ingebouwd in het genoom van de gastheer
○ E1A bindt en inactiveert Rb en E1B bindt en inactiveert p53.
● HPV: E6 en E7 worden ingebouwd in het genoom van de gastheer
○ E6 en E7 eiwitten inactiveren tumor suppressor eiwitten p53 en Rb
(respectievelijk), waardoor celgroei niet gecontroleerd kan worden en
kankercellen ontstaan.
, Hoofdstuk 4 - Cellulaire oncogenen
Het immuunsysteem bepaalt of getransformeerde cellen tumoren kunnen vormen. In
experimenten met muizen moet je hier rekening mee houden:
● Ingefokte genetisch identieke muizen (syngenetisch) maken
weefseltransplantaties tussen muizen van dezelfde stam mogelijk omdat het
immuunsysteem de getransplanteerde cellen niet als lichaamsvreemd herkent.
○ Uitgefokte populaties (natuurlijk) hebben genetische variatie en bij
transplantatie tussen dieren zal het immuunsysteem de getransplanteerde
cellen als lichaamsvreemd herkennen en afstoten.
● Immunogecomprimeerde muizen (naakt) hebben geen thymus en een defect
immuunsysteem waardoor er transplantatie van andere diersoorten kan plaatsvinden
(xenografts). Door hun gebrek aan haar is het makkelijk om de voortgang van
tumorvorming te volgen na injectie van getransformeerde cellen onder hun huid.
Retinoblastoma is een erfelijke tumor-suppressor. Er zijn 2 mutaties nodig, 1 daarvan kan
via kiembaan geërfd worden. Op vele manieren kan een wild-type tumor suppressor allel
verloren gaan, vaak wordt een (deel) van het chromosoom homozygoot voor de mutatie →
verlies van heterozygositeit.
Proto-oncogenen kunnen door verschillende processen (mutaties, genamplificatie,
chromosomale translocatie, insertiemutagenese) veranderen in oncogenen, die leiden tot
ongecontroleerde celgroei.
Tumor suppressors kunnen door verschillende processen (silencing, deleties, interactie met
onco-proteïnen, insertiemutagenese).
Naast virussen kunnen specifieke chemische substanties kanker induceren. Door chemisch
getransformeerde fibroblasten met DNA te transfecteren kunnen deze normale fibroblasten
worden. Zo kunnen ook normale cellen getransfecteerd worden met DNA uit
chemisch-getransformeerde cellen om de normale cellen te transformeren. De
getransfecteerde cellen bevatten een geactiveerd oncogen, dit kun je aantonen met
Southern blotting:
● Northern: toont RNA aan
● Western: toont eiwit aan
● Southern: toont DNA aan: transfer DNA wordt op een nitrocellulose filter gebracht en
gevisualiseerd met een radioactieve probe (of antilichaam), die het gen aantoont:
1. Genomisch DNA wordt geïsoleerd en geknipt met één of meerdere
restrictie-enzymen.
2. Vervolgens worden de DNA-fragmenten op grootte gescheiden via
agarose-gelelektroforese.
3. Het DNA wordt overgebracht op een nitrocellulose-membraan en
geïncubeerd met een radioactieve DNA-probe. De lengte van het
DNA-restrictiefragment (zichtbaar als band op de film) maakt het daarbij
mogelijk overeenkomst of verschil in genoomsequenties (en dus
restrictiesites) aan te tonen.
