Leerdoelen Research Strategies in Microbiology
Onderstaande generieke leerdoelen worden getoetst:
- toelichten waarom een bepaalde methode/ techniek gekozen is voor het beantwoorden van een
onderzoeksvraag.
- grafieken en tabellen met onderzoeksresultaten analyseren en interpreteren op kwaliteit (
betrouwbaarheid, controles).
- onderzoeksresultaten kritisch evalueren in relatie tot de onderzoeksvraag.
- aan de hand van onderzoeksresultaten (rekenkundig) beargumenteren en met onderbouwing
komen tot een conclusie.
- een selectie en keuze maken van technieken om een nieuwe onderzoeksvraag te beantwoorden
- een experimentele opzet bedenken gebaseerd op de wetenschappelijke methode om een
onderzoeksvraag te beantwoorden.
- diverse onderzoeksmethoden toe te passen op vergelijkbare situaties zoals behandeld tijdens de
cursus.
Thema 1: Modulatie van de immuunrespons door Staphylococcus aureus
M.o. kunnen op verschillende manieren ontsnappen van een ontstekingsreactie en het specifieke
immuunrespons van het lichaam. De stafylokokken zijn in staat om via verschillende wegen de
effector functie van het immuunsysteem te omzeilen. De bacterie produceert eiwitten die hem
helpen om de fagocytose te vermijden, door interactie aan te gaan met de complement factoren en
immunoglobulines van het immuunsysteem. Hoe doen stafylokokken dat? De technieken die
gebruikt zijn van een onderzoek naar virulentiefactoren van de stafylokok wordt in dit hoofdstuk
beschreven.
• De immunologische mechanismen, tijdens de onstekingsproces, van fagocytose en opsonisatie
benoemen
Chemotaxis: is het verplaatsen van een organisme in een reactie op een chemische stimuli. Bij een
ontsteking worden er door het complement systeem eiwitten afgescheiden (bv C5a). De C5a is een
chemo-attractant. Door afgifte van dit complement eiwit kan het afweermechanisme gestart
worden. De C5a geeft een signaal af naar de dichtstbijzijnde bloedvat, de granulocyten in het
bloedvat reageren hierop. Ze worden afgeremd en rollen over de wand, vervolgens zullen ze zich
hechten aan de bloedvatwand. De hechting wordt mogelijk gemaakt door het eiwit CD11b aan het
eiwit I-CAM 1. Na hechting migreren de leukocyten door de wand heen, dit heet diapedese. Door het
signaal van C5a verplaatsten ze zich naar de plek van infectie (chemotaxis). Wanneer de leukocyten
op de plaats van infectie zijn, zullen ze de bacterie fagocyteren en gaan vervolgens in apoptose.
Ontstekingsreactie
1. Bacterie dringt de huid door bij een wondje en gaat zich vermenigvuldigen.
2. Het complement systeem wordt geactiveerd (C5a). C5a
zorgt voor chemotaxis, het aantrekken van granulocyten
vanuit de bloedbaan. Er ontstaat adhesie van de
granulocyt op de wand van de bloedvaten.
3. Door chemotaxis van C5a wordt de granulocyt naar de
bacterie toe getrokken.
4. De granulocyt wordt geactiveerd zodra er een hoog
genoeg concentratie C5a is.
5. Fagocytose van de bacterie vindt plaats.
,Aangeboren afweer cellen: granulocyten, monocyten/macrofagen, dendritische cellen en
neutrofielen.
Complementsysteem
Er zijn meer dan 30 verschillende oplosbare eiwitten (pro-enzymen) in bloed en weefsels. Deze
worden geactiveerd door een enzymatische cascade. Hierbij splitst een inactief C-eiwit in een actieve
Ca en Cb eiwit. De actieve eiwitten kunnen vervolgens weer het volgende inactieve C-eiwit splitsen.
De eiwitten van de humane afweer zijn erg belangrijk, de 3 componenten van het complement
systeem:
1. Het labelen van cellen (opsonisatie) door C3b/C3bi en IgG
2. Chemotaxis door C5a (chemo-attractant)
3. Lysis van gram-negatieve bacteriën door C5b-9 complex
C5b-9 = MAC, membrane attack complex. Dit complex valt een membraan aan, het is opgebouwd uit
C5b, C6, C7, C8 en veel C9. Doden van bacteriën of andere target cel door lysis.
De afweer tegen invasie m.o. is het initiëren van een
ontstekingsreactie. Enzymatische klieving van C3 leidt tot Opsonisatie
vorming van C3a en C3b. De bacteriën worden geopsoniseerd
door C3b (bedekt met geactiveerd complement C3b). De
fagocyt heeft speciale receptoren voor het C3b. Het C3a zorgt
ervoor dat de chemotaxis wordt opgewekt. Het
fagocytoseproces begint met de activering van de
celmembraan door de binding van een geopsoniseerd m.o.
Daarnaast heeft het complement ook nog 3 andere functies:
1. Cellulaire activatie van mestcellen en fagocyten.
2. Stimuleren van een ontstekingsreactie.
3. Opruimen van immuuncomplexen (antigeen-antilichaam
complex).
Op welke wijze zou een
bacterie het proces van
een ontsteking kunnen
beïnvloeden?
- De opsonisatie, C3
blokkeren door een
pathogeen eiwit eraan te
laten binden.
- De chemotaxis
beïnvloeden, ervoor
zorgen dat C5a niet vrij
komt. Dus een eiwit wat de
chemotaxis beïnvloed.
,• Een beschrijving van de volgende microbiologische concepten; immunologische
ontwijkingsstrategieën van micro-organismen, pathogenicity island , virulentiefactoren en daarbij
voorbeelden noemen bij Stafylokokken.
Ontwijkingsstrategieën van m.o.
1. Verstoppen in een gastheercel
2. Modulatie van het immuunrespons (CHIPS)
3. Antigeen variatie:
- Binnen een gastheer of binnen populaties → geen herkenning meer door effector functie.
- Shedding van antigenen → verstoring van effectorfunctie van antistoffen.
- Moleculaire mimicry → verstoring van effectorfunctie van antistoffen.
- Verbergen van effectorfunctie van antistoffen → verstoring van effectorfunctie van antistoffen.
- Afbraak van antistoffen of complement factoren → verstoring van effectorfunctie van antistoffen.
Pathogeniciteits eilanden
Virulentiegenen bevinden zich op de pathogeniciteits eilanden (PAI). Dit is een specifieke klasse van
genomische eilanden die verkregen zijn door horizontale gen overdracht. Deze PAI’s zijn alleen
aanwezig bij pathogene, virulente stammen van bacterie species. Het pathogene eiland kan worden
overgedragen door middel van bacteriofagen. De bacteriofaag injecteert vreemd DNA in de bacterie,
de bacterie neemt het op in het bacteriële genoom. Algemene kenmerk van een PAI, is het DNA GC
hoeveelheid is net iets anders dan bij het overige genomische materiaal. Kan snel geanalyseerd
worden. Meestal stukken van 10-200 kb, ligt aan grote gen of hoeveelheid virulentie genen. Zitten
vaak bij DR, DR zijn sequenties van stukjes 16-20 steeds herhalingen en heel herkenbaar. DR is
herkenbaar voor fagen en enzymen om open te breken en een nieuw stuk DNA/RNA te plaatsen.
Virulentiefactoren bij Stafylokokken
Virulentiefactoren zijn stoffen die uitgescheiden worden door m.o. die ervoor zorgen dat het m.o.
ziekteverwekkende wordt voor de mens (bv toxines). De S. aureus beschikt over een groot aantal
virulentiefactoren: structurele componenten (kapsel, peptidoglycaan, teichoïnezuur, proteïne A en
eiwitten die zorgen voor binding aan fibronectine en collageen), enzymen (coagulase, catalase,
hyaluronidase, fibrinolysine, lipase en nuclease) en 3 soorten toxinen. Naast de genoemde
virulentiefactoren is de S.aureus in staat om het CHIPS eiwit te produceren. CHIPS staat voor
chemotaxis inhibitory protein of Staphylococci. Het eiwit blokkeert (remming) de chemotaxis en zorg
ervoor dat het complement systeem niet wordt geactiveerd.
,• Een beschrijving geven van een onderzoeksstrategie voor het onderzoek naar anti-inflammatoire
producten van bacteriën
Migratie van leukocyten is een belangrijke gebeurtenis, zowel bij de verdediging van de gastheer
tegen binnendringende pathogenen als bij ontstekingen. Bacteriën genereren chemoattractanten
voornamelijk door uitscheiding (geformyleerde peptiden), complementactivering (C5a) en vervolgens
door activering van leukocyten (bijv. Leukotrieen B4, bloedplaatjes-activerende factor en interleukine
8). Op welke wijze zou een bacterie het proces van ontsteking kunnen beïnvloeden?
1. Kijken welke cellen er worden geremd → Recepotor- ligand binding assay op cellen.
2. De receptor expressie en de chemotaxis in kaart brengen → Flowcytometrie & Transwell migration
assay.
3. Isolatie van het gewenste eiwit → Ligand chromatografie & SDS-PAGE.
4. Identificatie van het gen → Sequencing & PCR.
5. Het eiwit in vivo tot expressie laten komen → meten met antistof titers en eiwitten ELISA.
• Receptor-ligand binding assays op cellen , flowcytometrie experimenten en meting van antistof
titers en eiwitten beschrijven en data hiervan analyseren en interpreteren
Recepotor- ligand binding assay op cellen
Er zijn verschillende soorten ligand bindings assays: de radioactieve en de niet radioactieve
immunoprecipitation. De detectie methode wordt gebruikt om de aanwezigheid van een ligand-
receptor complex aan te duiden. De vloeistoffase ligandbindgstest van immunoprecipitatie (IP) is de
techniek waarbij een eiwitantigeen uit de oplossing wordt neergeslagen met behulp van een
antilichaam dat specifiek aan dat specifieke eiwit bindt. Dit proces kan worden gebruikt om een
bepaald eiwit te isoleren en te concentreren uit een monster dat vele duizenden verschillende
eiwitten bevat. Immunoprecipitatie vereist dat het antilichaam op een bepaald punt in de procedure
aan een vast substraat wordt gekoppeld. Wanneer het antigeenconcentratie laag is zal de
precipitatie ook minder zijn, het is dan ook moeilijk om een kleine hoeveelheid precipitaat te
isoleren.
Radioligands worden gebruikt om de ligandbinding aan receptoren te meten en zouden idealiter een
hoge affiniteit, lage niet-specifieke binding, hoge specifieke activiteit moeten hebben om lage
receptordichtheden te detecteren en receptorspecificiteit.
Een van de grootste verschillen tussen radioactieve en niet-radioactieve ligandbepalingen betreft
gevaren voor de menselijke gezondheid. Radioactieve assays zijn schadelijk omdat ze radioactief
afval produceren; terwijl niet-radioactieve ligandassays een andere methode gebruiken om te
voorkomen dat giftig afval wordt geproduceerd. Deze methoden omvatten, maar zijn niet beperkt
tot, fluorescentiepolarisatie (FP), fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) en oppervlakte-
plasmonresonantie (SPR).
Flowcytometrie
Flow-cytometrie wordt gebruikt voor het
identificeren en/of isoleren van cellen of
eiwitten. Bijvoorbeeld het onderzoeken van
cellen die aan CHIPS binden. De cellen en het
CHIPS eiwit worden gelabeld, wanneer de
cellen door de flowcytometer worden gehaald
kan de fluorescentie bepaald worden. Alleen
kan er zo geen onderscheid worden gemaakt
in welke cellen het precies zijn. Hiervoor
,moeten specifieke celmembraan eiwitten gebruikt worden zoals bv CD14. Cellen worden gelabeld
met specifieke antistoffen gerecht tegen celmembraan eiwitten (Ag). Alle antistoffen krijgen een
aparte kleur fluorescente labels. Bij de meting komt er een single cel stroom door een opening die
langs een laser komt. De laser detecteert de fluorescentie en mate van granulariteit van de cellen.
Hieruit ontstaat een scatterplot (dotplot) of een histogram.
Forward scatter is voor de grootte van de cellen en de side scatter is voor de mate van granulariteit.
Het gebruik maken van 2 kleuren wordt bijvoorbeeld gedaan bij het onderzoeken of er 2
verschillende receptoren op een cel zit. Wanneer een dotplot tegen elkaar uit wordt gezet kunnen de
populaties gedefinieerd worden.
Gating = het gemiddelde en de mediaan van de subpopulaties bepalen. In een scatterplot wordt er
een cirkel gemaakt om de cellen van interesse. Het omcirkelende gedeelte wordt opnieuw de
fluorescentie gemeten. Hiervan wordt een aparte histogram gemaakt. Een histogram heeft altijd een
logaritmische schaal. Wanneer de spreiding van een piek in een histogram te groot is, is de uitkomst
minder betrouwbaar. Daarom worden histogrammen altijd nog bekeken en worden waardes niet
zomaar overgenomen vanuit het systeem.
Belangrijk om te weten dat flowcytometrie een techniek is waarbij cellen worden geanalyseerd op:
- op grootte gebonden antistoffen
- mate van granula
- aanwezigheid van gebonden antistoffen
Transwell migration assay
Met de Transwell migration assay kan receptor expressie en de chemotaxis gemeten worden. De
assay wordt gebruikt voor een kwantitatieve bepaling van de
invloeden van verschillende factoren op de cel migratie. De migratie
van een eiwit wordt gemeten door bijvoorbeeld met de aantrekking
van een chemo-attractant. Het eiwit migreert door een micro-
poreuze membraan heen. Wanneer de chemotaxis wordt verhindert
door een ander eiwit/stof, zal er geen migratie plaats vinden. Het
mengsel in het onderste compartiment kan gemeten worden met
flowcytometrie.
CHIPS isolatie en zuivering
CHIPS wordt uit het supernatant (eiwit wat door de bacterie wordt uitgescheiden) geïsoleerd. Met
liganden chromatografie wordt het eiwit uit het supernatant geïsoleerd en gezuiverd.
Affiniteitschromatografie scheidt eiwitten op basis van een omkeerbare interactie tussen een eiwit
(of groep van eiwitten) en een specifiek ligand gekoppeld aan een chromatografiematrix. Hoe weet je
waar het eiwit zich bevindt? Het isoleren van fracties.
, Het verkregen isolaat wordt op een SDS-PAGE gezet om de grootte van het eiwit te kunnen
analyseren. Nadat de grootte bekend is wordt het isolaat schoon gemaakt d.m.v. ontzouting. De
samples die het verdachte eiwit zouden hebben worden geanalyseerd op activiteit van chemotaxis
met behulp van flowcytometrie.
Kloneren
Een andere manier om een verdacht eiwit tot expressie te kunnen brengen is klonen met
recombinant DNA technologie. Een gen wordt gekloneerd en tot expressie gebracht. Een
voorwaarden is dat er DNA nodig is en kloneren in een plasmide.
Identificatie met sequencing & PCR
Hoe kom je erachter welk eiwit wat veroorzaakt? Er is een eiwit maar je hebt geen idee waar het gen
zit. Het eiwit kan terugvertaald worden, de aminozuurvolgorde wordt bepaald en wordt terug
vertaald naar een DNA sequentie. Daarna kan er met verschillende primers voor de verschillende
tripletcodes een PCR gedaan worden en het eiwit wordt gevonden. Virulentie genen hebben een
andere opbouw in het DNA, ze zijn vaak GC rijk.
Er kan ook gekeken worden over verschillende stammen het verdachte eiwit tot expressie kunnen
brengen. Er kunnen verschillende stammen worden gebruikt: klinische stammen, gezonde stammen,
niet invasieve stammen en stammen die infecties geven in de bloedbaan.
Meting van antistof titers en eiwitten → ELISA
Een ELISA kan gebruikt worden om de productie van CHIPS in vivo te onderzoeken door het gebruik
van antistoffen (mAB). ELISA met monoklonale antistoffen als capture en polyklonale antilichamen
als detectie.
• Bestaande kennis uit de literatuur toepassen in de opzet en analyse van onderzoek naar eiwitten
afkomstig van Stafylokkokken
Men ontdekte dat de Staphylococcus aureus een eiwit uitscheid wat specifiek bindt aan de
neutrofielen en de monocyten. Het eiwit verhindert het immuunrespons. Er werd eerst getest of
CHIPS aan bloedcellen kon binden. Er werd hiervoor een kleuring uitgevoerd. Voor de kleuring van
CHIPS werd een FITC labelling van eiwit gedaan. Voor anti-CD14 is gekozen voor een PE antistof
labbeling. Ze hebben deze methode gebruikt om de binding te kunnen meten m.b.v. de fluorescente
markers.
1. Waar bindt CHIPS aan? → CHIPS binding to Blood Cells, welke
methode wordt er gebruikt? → Recepotor- ligand binding assay
op cellen:
Om de binding van CHIPS aan verschillende celtypes te bepalen,
werd FITC-gelabelde CHIPS (CHIPS-FITC) gebruikt. Vervolgens
werd CHIPS-FITC gescheiden van ongebonden FITC met behulp
van een G25-ontzoutingskolom. Fracties werden verzameld en
getest op de aanwezigheid van CHIPS en FITC in een
spectrofotometer. Fracties die CHIPS-FITC bevatten, werden
samengevoegd. Menselijke neutrofielen en mononucleaire
cellen werden geïncubeerd met toenemende concentraties
CHIPS-FITC in aanwezigheid van PE-geconjugeerd anti-CD14 mAb (voor een dosis respons curve).
Monsters werden geanalyseerd op een FACScan ™ -stroomcytometer en anti-CD14-kleuring om de
verschillende celpopulaties te onderscheiden. In afzonderlijke experimenten werd CHIPS-FITC-
binding getest op neutrofielen van muizen, konijnen, ratten, cavia's, varkens en honden. Specifieke
