Samenvatting vegetatieve vermeerdering
Leerdoelen Vegetatieve Vermeerdering:
1. Studenten kunnen het belang en het doel van weefselkweek en vegetatieve vermeerdering
uitleggen
• Begrijpen het belang en doel van weefselkweek en vegetatieve vermeerdering
• Kennen het verschil tussen in vitro vermeerdering en in vivo vermeerdering.
• Weten wat vegetatieve vermeerdering is en wanneer het toe te passen is.
2. Studenten kunnen aan de hand van een voorbeeldsituatie de vermeerderingsfactor en
concentraties/hoeveelheden van medium componenten berekenen
• Begrijpen wat de vermeerderingsfactor is en kunnen daar mee rekenen.
• Kunnen de concentraties en hoeveelheden van componenten in het medium berekenen
3. Studenten kunnen verschillende methodes en procedures van vegetatieve vermeerdering en
weefselkweek beschrijven en toepassen
• Kennen verschillende stek- en ent methodes
• Kennen de belangrijkste procedures om succesvolle in vivo en in vitro vermeerdering toe te
passen.
• Kunnen zelf medium maken, zijn bekend met een aantal verschillende methoden binnen de
praktische weefselkweek en begrijpen het belang van steriel werken.
4. Studenten kunnen aan de hand van een voorbeeldsituatie beargumenteren welke factoren van
invloed zijn op het resultaat van vegetatieve vermeerdering en weefselkweek
• Weten welke factoren van invloed zijn op een succesvolle vermeerdering bij de verschillende
stek- en ent methodes
• Kennen de belangrijkste factoren die van invloed zijn op in vitro cultuur.
5. Studenten begrijpen het belang van de (belangrijkste) toepassingen van in vitro technieken in de
plantenveredeling en gewasbescherming
• Kennen de belangrijkste toepassingen van in vitro technieken in de plantenveredeling en
gewasbescherming
• Begrijpen het belang van viruseliminatie en kennen de belangrijkste methoden om materiaal
virusvrij te maken.
• Begrijpen het belang van embryocultuur en kennen de belangrijkste gebruikte technieken
• Begrijpen het belang van antherencultuur en kennen de belangrijkste gebruikte technieken
• Begrijpen het belang van microsporencultuur en kennen de belangrijkste gebruikte
technieken
• Begrijpen het belang van protoplasten cultuur en kennen de belangrijkste gebruikte
technieken
,Hoofdstuk 1
1. Weefselkweek
Weefselkweek: is het kweken van planten of plantdelen op een kunstmatige voedingsbodem onder
steriele omstandigheden. Een andere naam voor weefselkweek is ‘’in vitro cultuur’’, wat letterlijk
‘’cultuur in glas’’ betekent. Delen van de plant die gebruikt kunnen worden bij weefselkweek zijn
onder andere: zaden, zaadknoppen, embryo’s, endosperm, meristemen, stengel- of bladstukjes,
brokjes mergparenchym, bollen, knollen, okselknoppen, helmhokjes, stuifmeelkorrels en zelfs losse
plantcellen. Deze explantaten moeten op een kunstmatige voedingsbodem, het medium, onder
gecontroleerde omstandigheden verder tot ontwikkeling komen.
Explantaat: is het plantendeel dat in vitro wordt gebracht (dit kunnen de bovengenoemde delen
zijn).
Drie biologische principes voor het begrijpen van weefselkweek:
1. Delen van planten en zelfs geïsoleerde plantencellen hebben het vermogen uit te groeien tot een
complete plant. Totipotentie is de mogelijkheid van één enkele cel, om alle cellen te vormen die een
individu bezit.
2. Groei- en ontwikkelingsprocessen in vitro moeten gecontroleerd en gestuurd worden. Hiervoor
wordt gebruik gemaakt van groeiregulatoren.
3. De ontwikkeling van het explantaat is op te vatten als een lange serie van celdelingen (mitosen),
die uiteindelijk moet leiden tot het eindproduct. Theoretisch verandert en door mitose niets aan de
het erfelijk materiaal, maar in de praktijk blijkt dat er vaak sprake is van genetische instabiliteit.
1.2 Totipotentie
Totipotentie: is de mogelijkheid van één enkele cel, om alle cellen te vormen die een individu bezit.
Zo is bijvoorbeeld een bevruchte eicel totipotent omdat deze uiteindelijk uitgroeit tot een geheel
individu.
Meristematische cellen: zijn totipotent. Zij produceren complete wortels of stengels en
geslachtscellen bestaan ook uit meristemen. Meristeem is de groep van stamcellen, waarmee
vaatplanten kunnen aangroeien.
Somatische cellen: zijn lichaamscellen/vegetatieve cellen. Zij kunnen zich differentiëren om
gespecialiseerde functies uit te voeren in het orgaan waar zij voorkomen. Tijdens dit differentiatie
proces blijft het genetische programma intact, echter wordt een deel van de genetische informatie
geblokkeerd. De cellen groeien dus alleen bij de juiste omstandigheden.
1.3 Groeiregulatoren
Groeiregulatoren: spelen een belangrijke rol omdat zij de groei in de plantenkweek kunnen
stimuleren, maar ook omdat zij de ontwikkeling kunnen sturen. In het DNA van de celkern liggen
verschillende ontwikkelingsmogelijkheden beschreven. Om ze in werking te stellen is er een prikkel
nodig. De verschillende groeiregulatoren zorgen voor deze prikkels. Er bestaan 5 groepen
groeiregulatoren: auxinen, cytokininen, gibberellinen, abscisine zuur (ABA) en ethyleen. De
gevoeligheid van een plantweefsel voor bepaalde soorten groeiregulatoren hangt samen met het
aantal receptoren en de gevoeligheid hiervan.
Abiotische factoren (omgevingsfactoren): de groei en ontwikkeling is ook afhankelijk van bepaalde
abiotische factoren zoals lichtkleur en lichtduur, temperatuur, vocht, luchtvochtigheid etc.
,Aan het medium kunnen groeiregulatoren worden toegevoegd. Als groeiregulatoren niet worden
toegevoegd zal de groei en ontwikkeling bepaald worden door de planthormonen die al aanwezig
waren in het explantaat.
Extra info: Lees blz 15 – 16 van je reader voor het onderzoek van Skoog (1944).
2. Factoren van invloed op in vitro cultuur
Er zijn meerdere factoren die invloed hebben op de in vitro cultuur zoals; de samenstelling van het
medium, de keuze van het explantaat, omgevingsfactoren en menselijk handelen (vb. niet steriel
werken).
2.1 Medium
Een medium bestaat over het algemeen over water en minerale zouten, maar in vaste vorm, ook uit
agar. Al deze dingen kunnen invloed hebben op de kweek.
Water: gedestilleerd of gedemineraliseerd water wordt gebruikt, nooit kraanwater.
Minerale zouten: Het meest gebruikte medium is het MS-medium (Murashige & Skoog). Het
zoutmengsel van dit medium bestaat uit macrozouten (N, P, K, Ca, Mg, Fe)(hier heeft een plant meer
van nodig macro) en microzouten (Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S, Mo, Co, Al en Ni )(hier heeft een plant
minder van nodig micro). Echter heeft elk gewas weer een andere samenstelling nodig en zal een
zoutgevoelig gewas minder zouten nodig hebben. Dit kan adhv een berekening berekend worden.
Agar: agar is stolmiddel dat wordt toegevoegd bij het bereiden van verschillende media. Er bestaat
natuurlijk agar dat gemaakt is van zeewier. De samenstelling van dit soort agar is variabel en het is
wat troebeler. Dit natuurlijke agar wordt gebruikt bij media met een concentratie van 0,7%. De
synthetische agar variant is CASAGAR. Deze wordt gebruikt in media met een concentratie van 0,2%.
Het voordeel van CASAGAR is dat het constant is van samenstelling en dat het doorzichtig is. Echter is
de werking ervan afhankelijk van een voldoende hoeveelheid Ca2+ en Mg2+ ionen. Meestal zijn deze
bij weefselkweek voldoende aanwezig in de media, maar zo niet dan kan beter een andere variant
van agar worden gebruikt. De manier van oplossen is bij beide varianten van agar verschillend.
Koolstofbron: Planten in vitro hebben in tegenstelling tot planten in vivo een koolstofbron nodig
omdat de fotosynthese nog niet optimaal is. Als energiebron kunnen sucrose, glucose en fructose
dienen. Andere suikers blijken minder geschikt. Ze bieden niet alleen energie maar houden ook de
osmotische waarde van het medium op peil.
Vitaminen: Planten in vitro kunnen meestal zelf voldoende vitaminen aanmaken zolang er stikstof
aanwezig is. Soms wordt uit voorzorg vitaminen toegediend.
Hormonen: Auxinen (IAA), Cytokininen, absiscinezuur (ABA), gibberellinen en ethyleen (meer over
ethyleen bij gasfase). De verhouding tussen de niveaus van auxinen en cytokininen blijkt erg
belangrijk te zijn. Veel auxine zorgt voor wortelvorming terwijl veel cytokininen zorgen voor
scheutvorming. Verhoudingen tussen deze twee groeiregulatoren zorgen voor callus
(eelt/huidverdikking).
2,4-D is een auxine die vaak wordt gebruikt voor de opwekking van callus. Het heeft een aantal
nadelige eigenschappen:
1. soms wordt de morfogenese geremd of negatief beïnvloed.
2. het kan mutaties induceren
3. veelal wordt de fotosynthese in vitro erdoor geremd.
, Het gebruik van cytokininen is afhankelijk van het explantaat. Sommige plantdelen kunnen
gemakkelijk zonder cytokininen.
Gibberellinen hebben een remmend effect op wortel en scheutgroei, maar zijn soms bevorderlijk
voor doorbreking van de kiemrust en strekking van internodiën. Daarom voegen ze dit pas toe als ze
bloemknoppen willen laten uitlopen, of in het geval van embryocultuur. Gibberellinen zijn
thermolabiel en kunnen dus niet gesteriliseerd worden in een hoge drukpan of autoclaaf.
Filtersterilisatie is dan nodig.
Absiscinezuur (ABA) heeft in het algemeen een negatieve invloed op de morfogenese. Soms is het
bevorderlijk voor de callusgroei en embryogenese. Ook voor het geschikt maken van het weefsel
voor cryopreservation (bewaring biologisch materiaal op lage temperatuur) is ABA een gewilde
factor.
Andere organische stoffen: meestal kan de plant zelf aminozuren synthetiseren, net als vitaminen.
Echter wordt soms kokosmelk of actieve kool toegevoegd welke de plantgroei kunnen bevorderen:
Kokosmelk: bevordert bij veel gewassen de groei, celdeling en differentiatie. Het bevat: cytokininen,
vrije aminozuren en myo-inositol (een stof die een rol in de synthese van fosfolipiden,
celwandpectinen en cytoplasmatische membraansystemen speelt).
Actieve kool: van actieve kool zijn zowel positieve als negatieve effecten bekend. Die effecten
kunnen toegeschreven worden aan 3 factoren:
- Actieve kool verdonkerd het medium waardoor de wortelinductie en groei worden
beïnvloed, maar ook de temperatuur van het medium moeilijker te regelen wordt.
- Adsorptie van remmende componenten zoals fenolachtige bestanddelen. Deze zouden de
groei van de wortels, maar ook van de scheut kunnen beïnvloeden.
- Adsorptie van hormonen uit het medium
Actieve kool wordt toegediend aan een medium wanneer men soorten wil vermeerderen via
somatische embryogenese (proces waarbij een embryo zich ontwikkelt uit lichaamscellen). De
aanvankelijk hoge auxineconcentratie die nodig is voor inductie van somatische embryo’s wordt
automatisch verlaagd doordat de actieve kool de auxine wegvangt. Ook beweren sommige
onderzoekers dat actieve kool een soort ‘slow release functie’ heeft, waardoor allerlei bestanddelen
langzaam ter beschikking komen voor het plantendeel. Het wordt meestal in concentraties tussen 0.5
en 3% toegevoegd.
Antibiotica en systemische fungiciden: Een van de grotere problemen bij de cel- en weefselkweek is
het verschijnen van inwendige besmettingen. Uitwendige sterilisatie is niet in staat diep in het
weefsel liggende schimmels en bacteriën te doden. Dit is vooral een probleem bij houtachtige
soorten. Om dit te voorkomen is geprobeerd om fungiciden en antibiotica aan het medium toe te
voegen. Echter kunnen er problemen optreden wanneer deze worden toegevoegd:
• Antibiotica zijn vaak schadelijk voor plantcellen: vooral aantasting van ribosomen vindt
plaats.
• Benomyl (fungicide) remt de ontwikkeling (zowel groei als morfogenese) van de plant.
• Het antibioticum of fungicide blijft in het medium achter na de kweek en zorgt dat daarmee
voor ‘verontreiniging’ van het afval. Dit medium zal dan eerst geautoclaveerd moeten
worden om de middelen (die hitte instabiel zijn) te inactiveren.
