Genoom samenvatting toets 1
Week 2
Blz 306: Signals encoded in DNA tell RNA polymerase where to start and stop
Voor transcriptie-initiatie in prokaryoten associeert de sigmafactor met polymerase, samen
vormen ze het polymerase holo-enzym. Ze glijden over het DNA en binden als ze de
promotor tegenkomen. De promotor is een DNA- sequentie die de start van transcriptie
aangeeft. Op de promotor opent het holo-enzym de dubbele DNA-helix. Dit geopende stuk
heet dan de transcriptiebubbel. De sigmafactor bindt aan de ene streng en polymerase
begint met transcriptie van de andere streng. Dit genereert spanning welke ervoor kan
zorgen dat de core factor (polymerase deel) van het holo- enzym losbreekt van de
sigmafactor en de transcriptie voortzet. Breekt het core-enzym niet los, dan worden er
steeds kleine stukjes RNA gegenereerd. Dit heet abortive intiation. Nucleotiden worden een
voor een gekoppeld in de elongatiefase tot polymerase de terminatiesequentie tegenkomt,
stopt met de transcriptie, het DNA loslaat en weer associeert met sigmafactor
Blz 307: transcription start and stop signals are heterogenous in nucleotide sequence
Een consensus-sequentie is een volgorde van nucleotiden waarin de meest voorkomende
nucleotide in een sequentie met dezelfde functie (bijvoorbeeld een promoter) wordt
weergegeven. Een consensus-sequentie zou je dus ook de ‘gemiddelde’ sequentie kunnen
noemen. De sterkte van een promoter wordt gedefinieerd als de hoeveelheid initiaties per
unit time op de promoter. De efficiëntie van zo’n promoter hangt af van hoe sterk de
promoter-sequentie op de consensus-sequentie lijkt. Terminator-sequenties vertonen een
grote verscheidenheid aan sequenties. Het belangrijkste gemeenschappelijke kenmerk is dat
het codeert voor een stukje RNA dat een haarspeld kan vormen door middel van base-paring
met zichzelf. RNA-polymerase (35) kunnen alleen binden aan 1 streng DNA en RNA
synthetiseren van 5’ naar 3’. Hierdoor wordt bepaald welke streng als template moet
worden gebuikt.
Blz 309: transcription initiation in eukaryotes requires many proteins
Er zijn verschillende soorten RNA-polymerases, type I, II en III. Allemaal zijn ze goed voor het
maken van verschillende soorten RNA's. Het is wel belangrijk om te zien dat bij transcriptie
van eukaryoten er sprake is van geen sigmafactor, maar wel andere transcriptiefactoren
zoals de TFIIx en TBP. Ook is er sprake van een chromatine structuur.
- RNA-polymerase I: 5.8S, 18S en 28S rRNA genen.
- RNA-polymerase II: alle eiwitcoderende genen, snoRNA, miRNA, siRNA, IncRNA en meeste
snRNA.
- RNA-polymerase III: tRNA genen, 5S rRNA, sommige snRNA en alle andere kleinere RNA's.
Blz 310: RNA polymerase 2 requires a set of general transcription factors
Er zijn dus andere transcriptiefactoren bij eukaryoten dan bij prokaryoten. Bij RNA-
polymerase II is er sprake van TFIIA, TFIIB, TFIIC, etc. De functie van deze transcriptiefactoren
lijkt erg op de functie van de sigmafactor van prokaryoten.
* functie transcriptiefactor: de algemene functie van een transcriptiefactor is dat het RNA-
polymerase de start van de transcriptie de TATAbox kan vinden. De transcriptiefactor TBP
(onderdeel van de TFFID) bindt aan de TATAbox (-30 van de start).
,* Uiteindelijk binden alle transcriptiefactoren, samen met het RNA-polymerase II en wordt
het initiation complex gevormd. De belangrijkste transcriptiefactor van dit complex is het
TFIIH en is belangrijk voor de initiatie van de transcriptie.
* Dus tijdens de initiatie vindt het RNA-polymerase II de start mbv de TBP en de TATAbox. De
andere transcriptiefactoren gaan ook binden en het initiation complex wordt gevormd.
Vervolgens zorgt het TFIIH voor de hydrolysering van ATP, waardoor hij het DNA kan
ontwinden en de template streng vrijkomt. Ook wordt er hier net als bij de prokaryoten
eerst kleine stukjes gevormd, waardoor het vervolgens in de elongatie fase kan gaan. Als
laatst worden er nog fosfaatgroepen aan de staart van de polymerase gevoegd en worden er
op de CTD ook essentiële eiwitten voor de elongatie gezet. Dit gebeurt tot het de TFIIH
tegenkomt. FIGUUR 6-14
Naam Number of subunits Roles in transiton initiation
TFIID 1 Herkent TATA box
TBP sub ~11 Herkent andere DNA seq. In de buurt van
TAF sub transcriptie start plek. Reguleert DNA-binding
dmv TBP
TFIIB 1 Herkent BRE-element in promoter. Positioneert
RNA-poly bij start site
TFIIF 3 Stabiliseert RNA-poly interactie met TBP en
TFIIB; helps attract TFIIE en TFIIH
TFIIE 2 Trekt aan en reguleert TFIIH
TFIIH 9 Ontwindt DNA bij transcriptie start punt
fosforyleerd Ser5 of CTD
Releases RNA-poly van promotor
Blz 312:Polymerase 2 also requires activator, mediator, and chromotin-modifying proteins
Er binden verschillende transcriptiefactoren rondom de sequentie waar de transcriptie moet
gaan beginnen. Hierdoor kan de RNA-polymerase het startpunt makkelijker vinden. Nu zijn
er verschillende soorten enzymen die ook gaan helpen.
- Activator: ATP chromatin remodelling complex en de hystone-modifications. Deze enzymen
zijn nodig, want het zorgt ervoor dat het DNA meer toegankelijk is voor de RNA- polymerase.
Enhancer = bindingsplek voor activator eiwit
- Mediator: het coördineren van de eiwitten op de promotor, zodat de transcriptie kan
beginnen. FIGUUR 6-18
Blz 315: Transcription elongation in eukaryotes is tightly coupled to RNA processing
De CTD-staart wordt eerst gefosforyleerd die ervoor zorgt dat het RNA-polymerase II wordt
herkend, maar ook zodat de 3 belangrijke CTD-eiwitten kunnen binden. Namelijk de Capping
op de 5' kant, splicing van intronen en polyadenylering op de 3'-kant kunnen gaan binden.
De fosforylering van de CTD-staart zorgt er in eerste instantie voor dat deze elongatie
eiwitten op de juiste volgorde kunnen de processen kunnen activeren. FIGUUR 6-20, FIGUUR
6-21 EN FIGUUR 6-22
5’ CAP: positief geladen 7-methyl guanosine residu met 5’-5’ trifosfaatbrug
, Figuur 6-22: CTD bevat 52 herhaling van 7 aminozuur lange sequenties met 2 serines in elke
herhaling. 1: fosforyleren Ser5 voor capping. 2: fosforyleren Ser2 voor elongatie. 3: splicing
4: poly-A. RNA polymerase kan pas herbruikt worden als alles wordt gedefosforyleerd.
Blz 317: RNA splicing removes intron sequences from newly transcribed pre-mRNA
Een intron wordt uit het RNA verwijderd met behulp van een spliceosoom. Tussen 2 exonen
zit een intron/intronen die moeten worden verwijderd als een lariaat. De machinery die het
intron verwijderd bestaat uit 5 belangrijke RNA-moleculen en 100'en verschillende soorten
eiwitten. Alle snRNPs samen vormen de core van het spliceosoom. Er zijn specifieke
sequenties die deze RNA's herkennen aan de intronen. Zo is er aan de 5' kant het AG-GU,
waar de snRNPs aan gaan binden en helpen het stukje dichter naar de A in het midden te
brengen, naar de branchpoint.
- Dit gebeurt met behulp van het U1, U4 en U6 snRNP. Hier kan de A, de branch point, een
binding aan gaan met het stukje intron.
- De branchpoint wordt herkend door het BBP en U2AF. de U2 snRNP verplaatst het BBP en
U2AFF en zorgt dat er een baseparing plaatsvindt met de consensus sequentie van de donor
(5' kant).
- Vervolgens gaan de U4/U6 en U5, de triple snRNP,, de reactie aan en de U4 en U6 blijven
bij elkaar en zorgen voor de baseparing. En dit zorgt voor de eerste fosforyltransferase
reactie. Tot slot wordt ook de 3' kant gekliefd aan het lariaat en blijft het lariaat/de intron
met de snRNPs los over.
Het exon junctin complex, EJC, is een complex dat wordt gebruikt na de splicing. Op de
plekken waar eerst het intron zat. Het EJC is belangrijk voor het controlemechanisme.
Door alternative splicing kunnen er meerdere mRNA's uit maar 1 pre-mRNA ontstaan.
Blz 319:Nucleotide sequences signal where splicing occurs + RNA splicing is performed by the
spliceosome
Tijdens een splicing-event zijn er twee fosforyl-transfer reacties, deze reacties zorgen ervoor
dat twee exons samenkomen en het intron daartussenin als ‘lariaat’ verwijderd wordt.
De splicing-machinerie moet drie stukken op het pre-mRNA herkennen: de 5’-splice-site, de
3’-splice-site en het ‘branch-point’: dit punt vormt samen de basis van het lariaat. Deze
plekken hebben hun eigen consensus-sequentie (de plek van splicing ligt dus vast in de RNA-
sequentie) en worden herkend door snRNA’s (small nuclear RNA’s). Er zijn vijf snRNA: U1,
U2, U4, U5 en U6. Deze snRNA’s vormen elk een complex met op z’n minst zeven eiwitten.
Dit comlex heet een snRNP. Alle snRNP’s samen vormen de core van het spliceosoom.
Bij de splicing reactie basenpaart de U1 snRNP met de 5’ splice-site. Het ‘branch-point
binding protein’ (BBP) en ‘U2 auxilliary factor (U2AF) herkennen de branch-point. BBP en
U2AF worden vervolgens vervangen door het U2 snRNP, die basepaart met het branchpoint.
Dan Wordt U1 snRNP vervangen door U6. Hiervoor is een herschikking nodig van het
U4/U6/U5 triple snRNP. Nu is er een actieve site gecreëerd die de eerste fosforyltransferase
reactie katalyseert. Het lariaat wordt geformeerd, en de 5’ splice-site gekliefd. Vervolgens
wordt ook de 3’ kant gekliefd, en blijft er een intron in de vorm van een lariaat met daaraan
snRNP’s over (het RNA wordt hiervan afgebroken in nucleus, de snRNP’s worden gerecycled)
en een gespliced mRNA.