Vaardigheid 1: Restrictie analyse ('Wie is de
moordenaar?')
Inleiding
Restrictie-enzymen
Restrictie-enzymen herkennen over het algemeen dubbelstrengs (ds) DNA basevolgorden van 4 tot 6
basen. Over het algemeen geldt dat verschillende restrictie-enzymen ook verschillende DNA
sequenties op het DNA herkennen. Hun specificiteit wordt beïnvloed door de temperatuur, de pH en
de concentratie NaCl in de buffer. De optimale reactietemperatuur van een restrictie-enzym komt
vaak overeen met de optimale omgevingstemperatuur van het organisme waaruit het enzym
geïsoleerd is. Daarnaast zijn deze enzymen afhankelijk van additionele enzymatische eigenschappen
en/of co-factor behoeften.
De activiteit van restrictie-enzymen wordt uitgedrukt in units (U): 1 unit restrictie-enzym is die
hoeveelheid restrictie-enzym, die in staat is om 1 μg ds DNA bij optimale incubatie-omstandigheden
in 1 uur volledig te knippen.
Herkenningssequentie (specifieke basevolgorde)
In het practicum worden de restrictie enzymen EcoRI en HindIII gebruikt om het DNA te knippen. De
herkenningssequentie van HindIII is:
in de 1e streng: 5' AAGCTT 3' na digestie met HindIII 5' A↓AGCTT 3'
in de 2e streng: 3' TTCGAA 5' ontstaat de breuk 3' TTCGA↑A 5'
HindIII herkent een specifieke volgorde van 6 basen en wordt daarom een 6-knipper genoemd.
Omdat DNA is opgebouwd uit een willekeurige combinatie van deze 4 nucleotiden is de kans dat
deze specifieke basevolgorde voorkomt dus éénmaal per 46 nucleotiden. HindIII zal dus, bij gelijke
verdeling van de base A, G, C en T, waarschijnlijk éénmaal per 4096 nucleotiden knippen.
DNA-marker
Een DNA-marker is een mix van lineaire DNA-fragmenten met bekende lengte (uitgedrukt in het
aantal baseparen). Door dit mengsel te scheiden op een agarose gel wordt een patroon zichtbaar.
Door de loopafstand van de marker banden te vergelijken met de loopafstand van
de DNA-fragmenten in het monster wordt duidelijk wat de grootte van deze DNA
fragmenten is.
Agarose gelelektroforese
DNA-restrictiefragmenten kunnen naar molecuulgrootte gescheiden worden door
middel van agarose gel-elektroforese. DNA-moleculen dragen, door aanwezige
fosfaatgroepen, bij neutrale pH een negatieve lading. Bij elektroforese zullen ze
dus naar de anode (+ pool) migreren. Bij de hier uit te voeren elektroforese zullen
de DNA-moleculen zich door een netwerk van agarosemoleculen moeten
bewegen. Lange (grote) moleculen zullen langzamer migreren dan korte (kleine)
,moleculen. Bij een geschikte agaroseconcentratie bestaat er een lineair verband tussen de logaritme
van de molecuulgrootte van een bepaald DNA-molecuul en de afgelegde afstand in de gel. DNA kan
op eenvoudige wijze in de gel aangetoond worden met behulp van SYBR safe, dat aan het DNA bindt.
Wanneer de gel onder UV-licht bekeken wordt, fluoresceert alleen het SYBR safe dat aan DNA is
gebonden. DNA is dan zichtbaar als oranje bandjes. De gel kan gefotografeerd of gescand worden.
Zowel horizontale- als verticale elektroforese is mogelijk, terwijl er ook een grote variatie in gebruikte
buffersystemen bestaat. In dit practicum zal (horizontale) submariene agarose gel-elektroforese
uitgevoerd worden. Bij deze methode ligt de gel geheel in/onder de buffer.
Aan de te elektroforeren monsters wordt een zogenaamde loadingbuffer, die sucrose bevat
toegevoegd. Sucrose heeft een grotere dichtheid dan water, daarom zakt het mengsel in het slotje
naar beneden. Tijdens het pipetteren moet je het monster voorzichtig in het slotje aanbrengen.
Doel:
Het doel van dit experiment is het leren hoe je een DNA-digestie uitvoert en hoe je de DNA-
fragmenten vervolgens kunt scheiden op een agarose gel.
vaat 1
Dit is het eerste enzym (I) dat uit de stam R van de bacterie Escherichia coli geïsoleerd werd. Dit
enzym knipt het DNA op plaatsen waar de basensequentie G I AATTC (of CTTAA I G in de
complementaire streng) voorkomt. Op de plaats van de verticale streep wordt geknipt. Enkel het
virale DNA wordt geknipt. In het eigen (bacteriële) DNA zit immers een soort van afscherming tegen
dit knipenzym. De EcoRI-herkenningssequentie is in het λ-DNA aanwezig op 5 verschillende plaatsen.
Na inwerking van dit enzym op het λ-DNA ontstaan er dus 6 verschillende DNA-fragmenten
vaatje 2
Hind-enzymes zijn afkomstig van de bacterie Haemophilus influenza. Vooral de restricie-enzymen
type II en type III van deze bacterie worden frequent gebruikt. Deze 2 verschillende enzymen zijn
werkzaam tegen 2 diverse virussen. Ze hebben ook totaal andere knipfrequenties. Tijdens dit
practicum gebruiken wij het type III. Dit enzym knipt het DNA bij de volgende herkenningssequentie:
A I AGCTT. Deze sequentie komt op 7 plaatsen voor in het genoom van de λ-faag. Er zullen dus 8
DNA-fragmenten ontstaan na restrictie door het HindIII-enzym.
dus vaatje 6 fragmenten en vaatje 2 8 fragmenten
,Originele voorschrift:
Naast de specifieke protocollen zijn er in het DNA werk een aantal vaste werkafspraken waar men
zich tijdens het uitvoeren van dit practicum aan moet houden:
Maak je werkplek schoon met 70% ethanol.
Houd alle oplossingen schoon; in principe zijn alle oplossingen geautoclaveerd of gefiltreerd
(filter gesteriliseerd) zodat de oplossingen vrij zijn van micro-organismen, die anders in korte
tijd DNA zouden afbreken.
Voorkom dat disposables zoals eppendorfvaatjes (epjes), puntjes besmet worden met
DNAse. DNAse is een enzym dat DNA afbreekt en dat door veel bacteriën wordt
uitgescheiden, ook door de bacteriën van de huidflora. Pak epjes en pipetpunten dus niet
met je blote handen vast maar met een pincet of draag handschoenen.
Restrictie-enzymen zijn erg duur en niet al te stabiel bij kamertemperatuur. Oplossingen met
restrictie-enzymen moeten daarom buiten de vriezer altijd op ijs. Pak nooit een epje, waarin
een oplossing met restrictie-enzym zit, vast aan de onderkant (het puntje), maar altijd bij het
dekseltje, omdat anders de enzymoplossing onnodig warm wordt.
Pipetteer oplossingen van restrictie-enzymen en DNA met een schoon, niet eerder gebruikt
puntje. De oplossingen met restrictie-enzymen bevatten 50% glycerol (visceus), laat de
pipetknop langzaam terugveren na indrukken.
Merk alle epjes, reageerbuisjes etc. duidelijk, zodat leesbaar is wat er inzit en van wie iets is.
We gaan het DNA monster (gemerkt met ?) dat mogelijk afkomstig is van de dader vergelijken met
de DNA monsters van een aantal verdachten.
De 6 monsters zijn als volgt gemerkt:
?: mogelijk afkomstig van de dader
A: afkomstig van verdachte no. 1
B: afkomstig van verdachte no. 2
C: afkomstig van verdachte no. 3
D: afkomstig van verdachte no. 4
E: afkomstig van het slachtoffer
Protocol 1: Digestie van de DNA-monsters
Benodigdheden
Restrictie buffer (10x geconc.): "One phor all" buffer (OPA)
Steriel gedestilleerd water
Restrictie enzymen: een mengsel van EcoRI en HindIII (elk 5 U/l)
λPstI DNA-marker (deze bevat al loadingbuffer).
DNA-monsters A, B, C, D, E en ?.
Loadingbuffer (5x geconc.): [50 mM Tris pH 8 + 10 mM EDTA + 1% SDS + 50% sucrose + 0,1 %
orange G en broomfenolblauw]
Werkwijze
1. Zet de monsters in ijs.
2. Pipetteer 4μl van een monster (zo laag mogelijk) in een epje en voeg 10μl steriel gedestilleerd
water toe.
3. Meng goed en voeg 2μl restrictie-buffer (10x) toe.
4. Voeg als laatste 4μl restrictie-enzym toe.
5. Sluit het epje, meng goed en centrifugeer de epjes met de monsters enkele seconden zodat het
restrictie mengsel zich beneden in het epje bevindt.
6. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij 37°C. (prepareer in de tussentijd de gel)
7. Voeg na de digestie 5μl 5x loading buffer toe aan elk epje, meng de monsters goed en centrifugeer
ze zodat de vloeistof weer onderin het epje zit.
, Protocol 2: Preparatie van de gel voor gelelectroforese
Benodigdheden
Agarose (gezuiverd, vaste stof), geschikt voor DNA electroforese
Electroforese buffer: 10x geconcentreerd. TAE (Tris-Azijnzuur-EDTA), pH 8,3
Electroforesebak, kam met 20 slotjes (openingen). Een kam met 20 slots geeft een gel met 20
opbrengplaatsen voor DNA-monsters. Er kunnen nu 18 (3x6)monsters en 2 maal de λPstI
marker op 1 gel worden gebracht.
Geltray
SYBR safe 10 mg/ml. SYBR safe is carcinogeen; vermijd dus huidcontact met SYBR safe
bevattende oplossingen en draag blauwe handschoenen!!!
Werkwijze (maak per 2 of 3 koppels 1 gel)
1. Maak de geltray schoon met demi water. Gebruik absoluut geen aceton of ethanol (kan de
geltray niet tegen) en maak de geltray als volgt gereed:
2. Plak de randen van geltray nauwkeurig af met de daarvoor geschikte tape. Druk de tape goed
vast op de randen van de tray, zodanig dat er straks geen vloeistof langs kan lekken.
3. Zet de tray waterpas op de labtafel.
4. Plaats de kam op de geltray zodanig dat de kam niet op de bodem rust maar dat er 1 mm
ruimte tussen de kam en de bodem aanwezig is. Anders lekt je monster uit de slots weg.
5. Maak 700 ml 1,0x TAE buffer (uit de stock oplossing van 10x TAE).
6. Breng in een 250 ml erlenmeyer eerst een hoeveelheid agarose en voeg hierbij 100 ml 1,0x
TAE zodat er een agarosedichtheid van 0,8 massa% ontstaat.
7. Meng de suspensie voorzichtig en verwarm vervolgens in de magnetron. Zwenk hierbij de
erlenmeyer regelmatig terwijl de agarose opgelost wordt. Ga daarbij als volgt te werk: Stop
de magnetron iedere 30 seconden en zwenk de erlenmeyer om de niet opgeloste agarose te
suspenderen. Pas op voor knoeien en verbranding: de oplossing kan bij oververhitting erg
gaan schuimen! Ga door totdat de oplossing helemaal helder en homogeen geworden is
(totaal ongeveer 5 minuten).
8. Laat de oplossing bij kamertemperatuur (of in een waterbad) afkoelen tot 55-60°C.
9. Voeg daarna, met handschoenen aan, 5μl SYBR safe oplossing toe en zwenk de oplossing
nogmaals goed.
10. Giet de agarose oplossing langzaam in de geltray. De temperatuur van de oplossing mag
maximaal 60°C zijn (als je de erlenmeyer 10 seconden in je blote handen kunt vasthouden is
het ver genoeg afgekoeld). Wanneer de agarose te warm wordt gegoten, veroorzaakt dit
krom trekken of craqueleren van de geltray. Voorkom het ontstaan van luchtbellen door de
oplossing rustig te gieten. Mochten er toch luchtbellen ontstaan, verwijder deze dan
onmiddellijk met behulp van een Pasteurse pipet.
11. Laat de gel na het gieten stollen (15-30 minuten).
