College aantekeningen
CIE hoorcolleges uitgewerkt
- Vak
- CIE
- Instelling
- Hogeschool Leiden (HSL)
(bijna) alles wat je moet weten voor CIE. Afgerond met een 8.5
[Meer zien]Voorbeeld 3 van de 16 pagina's
Voorbeeld 3 van de 16 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Voorbeeld van de inhoud
Hoorcollege 1 FlowcytometrieFlowcytometrie: een methode om cellen te typeren met welke cellen heb je te maken en hoe is de expressie?
Functie van het immuunsysteem: bescherming tegen pathogenen. Reageert deze wel, dan verandert de cel.
(immunologisch) onderzoek: Identificatie van celtypen, karakteriseren van cellen en isoleren van cellen
(functionele testen uitvoeren). Je wilt cellen volgen en zien hoe ze reageren. Hiervoor voer je de isolatie uit.
CD-markers om te isoleren. Cellulaire moleculen die aan de buitenkant van de cel zitten. Deze kunnen specifiek
zijn voor bepaalde celtypen. Op het moment dat de cellen gaan differentiëren, gaan de CD-markers eraf en zullen
er andere op de cellen komen. Bijv. granulocyt, CD15. T-cellen CD#. CD19 op B-cellen.
Naïef T-cel: kan van alles nog worden (binnen T-cel), Cytotoxische T-cel: veroorzaakt apoptose. Doodt cellen die
geïnfecteerd zijn. Dit is CD8
Om te weten welke van die CD-markers er op zo’n cel zit kan je het Identificeren met
immunochemie/immunofluorescentie (met antilichamen). Wordt door B-cellen geproduceerd in een specifieke
reactie op specifieke antigenen. Deze zijn geel stabiel.
Je kunt een label aan een antilichaam zetten. Dit kan fluorescent of immunochemisch zijn.
Elisa, western blotting en flowcytometrie zijn allemaal gebaseerd op antilichamen die kunnen binden.
Verschillende antilichamen zullen dus verschillende kleuren geven.
Directe/indirecte detectiemethode. Door primair antilichaam, binden aan cel (epithopen). Dan heeft deze gelijk
de antilichaam gebonden. Na primair antilichaam, laten binden en daarna weg wassen. Vervolgens tweede
antilichaam binden en overige wegwassen na het binden.
Flowcytrometry:
Cyto= cellen
Metry= meten
Flow= in een stroom
Dus je meet cellen in een stroom
Wanneer wil je een direct gelabeld antilichaam gebruiken en wat is het nadeel?
- Dan zullen alle antilichamen binden en is het aspecifiek. Dit wil je wanneer je meerdere kleuren en
dingen wilt meten in zo een cel.
Bij western blot: indirect gelabelde antilichamen en ook bij ELISA.
Flowcytometrie: met fluorescente labels. Hierbij wordt de marker/label aangestraald. De label kan
FITC (groen) zijn. Dat vangt het licht op van een bepaalde excitatie. Vervolgens straalt dit, door de
energie die gekregen wordt, een andere golflengte licht weer uit. Deze kun je specifiek meten. Als
het een bepaalde golflengte is, is een bepaalde label aangeslagen.
- Groen: FITC (uit kwallen)
- Geel: PE
Je straalt dus een soort licht in en er komt een ander soort licht uit. Dat is goed, want dan kun je
makkelijker onderscheid maken. Tussen bepaalde pieken zal overlap in zitten in het emissie
spectrum. Dit moet je compenseren (HC1, dia 11). Er zal overstraling zijn van het ene type licht
naar het andere type licht. Daarvoor moet je de juiste controles meenemen. Zonder controles bij
FACS kun je niks over je data zeggen.
Bij microscopie kun je ook fluorescente antilichamen gebruiken waarmee je iets kunt
herkennen in de cel.
,- Voordeel: bepalen van de locatie van cellen/antigenen
- Nadeel: Kost veel tijd en het is moeilijk te kwantificeren (subjectief)
Je hebt een idee en verwachting en dan vind je die. Daar maak je foto’s van etc. vervolgens dan is
dat niet het enige. Je moet er objectiever naar kijken. Dat kan met FACS. voor de FACS gebruiken
we een flowcytometer.
Wat doet een flowcytometer?
Cellen in een suspensie worden gelabeld met antilichamen met fluorchroom. De cellen worden
geanalyseerd met behulp van een detector. Dit is een snelle, individuele analyse van vele cellen
(>10.000).
Bv. Bloed, in suspensie zitten bloedcellen. Deze kun je afdraaien en dan is de pellet over. Je wast
dan alles weg wat je niet wilt hebben. Daarna kun je ze incuberen met antilichamen. Dit kun je
onder een apparaat met dunne naald zetten. Vervolgens wordt dit opgezogen. Dan zal een
stroompje gegenereerd worden, waarbij elk druppeltje 1 cel bevat. Die laser zal dan licht uitstralen,
die een bepaalde golflengte heeft. Dus dan worden de antilichamen worden aangeslagen als die
erin zitten. Deze golflengte zal dan gemeten kunnen worden. Dan weten we welke antilichamen
hierin zitten. Dit is heel snel en heel objectief (i.p.v. de verwachting, zelf vinden, etc.).
In flowcytometer: meerdere fluorescerende kanalen. Er wordt verschillende soorten licht naar die
cellen gestraald. Er is een forward scatter detector (FSD) en de side scatter detector (SSC).
Guave programma
Er zullen grafieken ontstaan, waarbij elke stip een cel is, in dotplot. Forwards scatter (FSC) en Side
Scatter (SSC) zeggen al veel over met welke cellen je te maken hebt. Het zegt iets over de grootte
van de cel en hoeveel granulen er in de cel zitten.
FSC: zegt iets over de grootte van de cel
SSC: zegt iets over de granulariteit van de cel
Hoe groter de cel, hoe hoger de stip in de plot. In dit geval, zal een monocyt hoger liggen dan
een rode bloedcel. Qua granules, zal de neutrofiel weer hoger liggen.
Hoe werkt dit?
Er wordt een lichtstraal op de cellen gebracht. De SSC meet hoeveel licht er van de cel wordt
afgekaatst naar de zijkant. Hoe meer granulen, hoe meer licht hiertegen aan zal botsen en hoe
meer SSC zal afgeven.
De FSC: hoe groter de cel, hoe groter de hoek dat de weerkaatsing is.
Naast FSC en SSC zullen er ook dotplots van de fluorescentie zijn. (dotplots met gate: kwadrant)
op y: groene fluorescentie.
De gate stel je in op basis van de ongekleurde cellen. Als de cellen voorbij de gate zijn, zijn deze
positief voor de fluorescentie.
DOTPLOT afbeelding + uitleg in samenvatting. HC1 – dia 25.
T-cellen zijn CD3 positief. Aantal die CD4 positief zijn.
Stel, ik heb een bloedsample. Ik wil hiervan weten hoeveel cellen de T-helpercellen zijn. Dan kan ik
labelen met antilichamen tegen CD3, die hebben een groene fluorescente label. Antilichamen tegen
CD4, met een rode fluorescente label. Hiermee kun je kijken hoeveel procent positief is. T-
helpercellen hebben zowel CD3 als CD4. Hierbij moet je altijd een ongekleurd sample/isotype
meenemen om te bepalen waar de negatieve cellen liggen. Met de dotplot kun je de cellen
aangeven met percentages.
Controle sample: ongekleurd isotype
Je moet zelf tegen het apparaat zeggen wanneer iets positief of negatief is (in dotplot). We hebben
dus antilichamen die bij de cellen komen. Dit gaat vervolgens door apparaat. Om het raster (dia 26)
te kunnen zetten, neem je een ongekleurd sample mee.
Je kunt ook als controle een isotype meenemen. Dit is een controle met antilichamen die nergens
tegen gericht is. Die is soms wel beter. In ons geval krijgen wij een ongekleurd sample. Bij
ongekleurd sample weet je, omdat je er geen antilichaam bij hebt gedaan, dat dit sample in de
linker hoek onder ligt. Hier kun je een gate omheen zetten. De cellen die buiten die gate vallen, die
zijn positief. Apparaat geeft zelf aan welke percentages dit zijn.
Fluorescentie intensiteit
Je kunt dus kijken of ze positief of negatief zijn. Je kunt ook kijken hoe positief of negatief deze zijn.
Dit kan namelijk iets zeggen over hoe actief deze cellen zijn. Dit doe je door de antilichamen erbij te
doen. Als deze niet gebonden worden, hebben ze geen CD25. Bij een beetje CD25, is er een beetje
, antilichaam dat zich bind (dan worden ze ook een beetje fluorescent). Als ze nog meer antilichamen
binden, zijn ze nog positiever. Dus je hebt laag-, intermediair- en hoog positief.
Voor CIE komt er een praktijk toets. Deze soort vraag zal er zeker in komen!!
Hoe beinvloed doorstraling je meting?
Om te controleren of het signaal niet afkomstig is van een doorstraling/andere piek, neem je als
controle een enkelkleuring mee. Dus, bijvoorbeeld CD3 FITC kleuren en CD4 PE kleuring. Je wilt
namelijk zeker weten dat wat je ziet, positief is voor wat je echt ziet.
: sample waarvan je weet dat je maar 1 antilichaam hebt toegevoegd. Dus alleen CD3-FITC
bijvoorbeeld. Wanneer deze in de FACS zit en je ziet signaal in een andere as, weet je dat daar iets
niet goed zit. FITC straalt dan bv. door in PE. Wat je dan meet, is de doorstraling in een andere piek.
Je moet dan tegen het apparaat zeggen dat het eraf getrokken moet worden. Dit doe je door die
enkel kleuringen mee te nemen. Vaak is het handig om ongekleurd mee te nemen die niet positief
of negatief zijn. Je ziet dan bij niet-compensatie dat er verschil in zit. Je wilt namelijk dat de kernen
van beide samples op 1 lijn liggen. (dia 29).
Je neemt het ene, min het andere. Als je dus PE signaal omlaag wilt hebbem moet PE-FITC. Als je
gaat FACS gebruiken, dan weet je zeker als het signaal hoger uitkomt, dat dit afkomstig is uit PE en
niet FITC.
Uiteindelijk wil je in een dotplot cellen analyseren. Dit doe je door rondom de cellen gates te zetten.
Vragen:
Wat bepaal je met de forward scatter en hoe doe je dat?
Je bepaalt de grootte van de cel. De hoeveelheid die van de cel wordt afgekaatst en je kunt dan de
hoeveelheid meten / grootte door te kijken hoever het licht is?
Waar staat FACS voor?
Fluorescence-Activated Cell Sorting
Dit is een enkelkleuring voor CD4-PE. Hoe moet dit
sample gecompenseerd worden?
Door..
A: FITC-PE↑
B: PE-FITC↑
C: FITC-PE↓
D: PE-FITC↓
Het moet naar rechtsonder. We zien signaal in FITC
terwijl dat er helemaal niet in zit want we hebben er
geen antilichaam voor inzitten dus het kan niet
positief zijn. FITC-signaal bestaat helemaal niet, is
er niet dus vals positief. Het is eigenlijk PE-signaal
en het moet terug naar 0 dus moet je FITC-PE signaal en dan moet het omhoog omdat het -PE is wat
omhoog moet (het signaal).
Wat is het percentage CD8+ T cellen?
64%: 29% + 35%
Hoeveel % van de CD4+ cellen is CD8+?
52%:
1. Eerst alle CD4 cellen bij elkaar: 32+35=67%
2. Hoeveel % is daarvan CD8: 35%
4. 35/67x100%=52% is CD8+
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper vascocr. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €3,79. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 56326 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen