MBOC SAMENVATTING
DEELTENTAMEN 1
2021-2022: Molecular Biology of the Cell (BMW33416)
Deibel, B.L. (Bo)
,Inhoudsopgave
Hoorcollege 1: membraanarchitectuur ................................................................................................... 3
Membranen in evolutie ....................................................................................................................... 3
Opbouw membranen .......................................................................................................................... 4
Structuur en eigenschappen van lipiden ............................................................................................. 5
Smelten van lipiden (voornamelijk verzadigde lipiden) ...................................................................... 5
Rol kopgroepen lipiden ....................................................................................................................... 7
Toepassingen ....................................................................................................................................... 8
Tumorweefsel .................................................................................................................................. 9
Hoorcollege 2: membraanarchitectuur ................................................................................................. 10
Alfa-helix ............................................................................................................................................ 11
B-sheets en B-barrels ........................................................................................................................ 11
Membraaneigenschappen en hun invloed op membraaneiwitten .................................................. 12
Reconstructie experiment ............................................................................................................. 13
Lipide packing (laterale drukprofiel) ................................................................................................. 15
Anesthetica .................................................................................................................................... 15
Interacties van wateroplosbare eiwitten met membranen .............................................................. 16
Antimicrobiele peptiden................................................................................................................ 16
Amyloiden ......................................................................................................................................... 17
Type 2 diabetes (IAPP peptide) ..................................................................................................... 18
Hoorcollege 3: membraanbiogenese .................................................................................................... 22
Functies ............................................................................................................................................. 22
Biogenese van membraaneiwitten ................................................................................................... 22
Mitochondriën ............................................................................................................................... 23
Endoplasmatisch reticulum ........................................................................................................... 27
Biogenese van de lipidenmatrix van membranen ............................................................................. 32
Hoorcollege 4: membraanbiogenese .................................................................................................... 33
Specifieke functies van membraanlipiden in specifieke lipide-eiwit interacties .............................. 33
Blue native SDS-page voor het detecteren van membraaneiwitcomplexen ................................ 34
Biosynthese van fosfolipiden en intracellulair transport .................................................................. 36
Vetzuursynthese ............................................................................................................................ 36
Biosynthese van glycerofosfolipiden ............................................................................................. 38
Omzetting van PE uit PS en van PC uit PE ......................................................................................... 39
Intracellulair transport van fosfolipiden ........................................................................................... 40
Transport van lipiden naar mitochondriën vanuit het ER ............................................................. 40
Lipid equilibratie over de helften van het ER membraan ................................................................. 42
, Plasmembraan................................................................................................................................... 44
Regulatie cholesterol biosynthese .................................................................................................... 45
Hoorcollege 5: Signaaltransductie......................................................................................................... 46
Homeostase....................................................................................................................................... 47
Feedback........................................................................................................................................ 47
Eiwitten ............................................................................................................................................. 49
Alpha-helices en beta-sheets ........................................................................................................ 49
Eiwitdomeinen .................................................................................................................................. 49
Post-translationele modificatie ......................................................................................................... 51
Moleculaire schakelaars .................................................................................................................... 51
Monomeric GTPases...................................................................................................................... 53
Heterotrimere GTP-eiwitten en GPCRs ............................................................................................. 57
Gs ................................................................................................................................................... 58
Gi ................................................................................................................................................... 59
Turning off GPCR-signalen ............................................................................................................. 60
Hoorcollege 6: Signaaltransductie......................................................................................................... 61
Gq .................................................................................................................................................. 61
Gt ................................................................................................................................................... 63
Enzyme coupled receptoren ............................................................................................................. 64
Tyrosine kinase receptor (RTK)...................................................................................................... 64
RAS-MAP kinase route....................................................................................................................... 66
Hoorcollege 7: Signaaltransductie......................................................................................................... 68
Ubiquitinering.................................................................................................................................... 68
Wnt-signaling route ........................................................................................................................... 69
Signaaltransductie route: distributie en integratie ........................................................................... 70
Kwantitatieve aspecten van signalering ........................................................................................ 71
Negatieve feedback methodes.......................................................................................................... 72
Voorbeeld negatieve feedback NFkB ............................................................................................ 73
Positieve feedback methodes ........................................................................................................... 73
Voorbeeld positieve feedback MyoD ............................................................................................ 73
Ligand binding affiniteit..................................................................................................................... 74
Hoorcollege 8: onderzoeksmethoden ................................................................................................... 76
Nuclear import .................................................................................................................................. 76
Lokalisatie van een eiwit bestuderen ................................................................................................ 77
FRET; fluorescence resonance energy transfer ............................................................................. 80
(co)immunoprecipitatie................................................................................................................. 80
, GST- pull down .............................................................................................................................. 81
Hoorcollege 1: membraanarchitectuur
In dit hoorcollege biologische membranen en modelmembranen. Modelmembranen kan je zelf
maken in een reageerbuis en zijn een soort kunstcelletjes waarbij je de lipiden en eiwitten zelf kiest.
Hierbij kan je naar eigenschappen van lipiden en eiwitten kijken en hun interacties. Inzichten
verkrijgen m.b.v. modelmembranen.
Goedwerkend membraan is essentieel voor gezonde cel
- Permeabiliteit barrière: moet niet lekken
- Selectief transport: stoffen selectief kunnen doorlaten
- Communicatie tussen binnen en buiten: signalen kunnen doorgeven
- Energielevering en opslag: aan de hand van de ionen gradiënt. (Bv. Mitochondriële binnen
membraan, ATP-synthese → zonder membranen geen ATP)
- Grote dynamiek: kunnen afsplitsen en fuseren zonder lekken. Heel veel transport van
intracellulaire deeltjes, waarbij veel fusie en afsplitsing processen plaatsvinden.
Het is een belangrijke barrière voor: medicijnen, toxische stoffen (maken gaatjes in membraan
waardoor de cel doodgaat) en virussen. Veel giftige stoffen hebben de membraan als target, dus
belangrijke barrière.
Membranen in evolutie
Vroeg in de evolutie fungeerde RNA als een primitieve katalysator, omdat het op veel verschillende
manieren zich kon vouwen en daarbij reacties kan katalyseren; door 4 bouwstenen maar erg beperkt.
Ook gaf RNA de genetische informatie door. Eiwitten namen functie over met 20 bouwstenen
waardoor de genetische informatie nu in DNA zit. In RNA snel mutaties en in DNA is de genetische
informatieoverdracht nauwkeuriger (dubbelstrengs).
Membranen in de evolutie als zeepbelletjes en later overgenomen door lipiden en
eiwitten als barrière.
Zeepbel is een amfipatisch molecuul: apolair/hydrofoob gedeelte dat niet met
water in aanraking wil komen, en polair/hydrofiel gedeelte dat wel met water in
aanraking wil komen.
Zeepbel → zelf-assemblage van amfipatische moleculen in lucht met een heel klein
beetje water → polaire/hydrofiel/kopgroep in aanraking met water en de staarten
(hydrofoob) in aanraking met lucht.
Veel water met geen lucht met dezelfde moleculen → primitieve membraan
waarbij hydrofiele gedeelte zijn in aanraking met het water en hydrofobe delen
naar elkaar gericht (naar binnen) en dus afgeschermd van het water: dubbelaag.
Afbeelding hiernaast zal zich als een vesical vormen waarbij alle staarten
afgeschermd zijn van het water.
,Amfipatische moleculen kunnen op verschillende manieren zelf-
assembleren. Bilaag organisatie of micel organisatie heeft te maken met
de vorm van de moleculen. Polaire groep relatief groot → micel. Een
cilindrische vorm → bilaag. De drijvende kracht is de hydrofobe delen
afschermen van het water.
Hydrofobe effect → watermoleculen hebben sterke interactie onderling
(waterstofbruggen), maar kunnen geen gunstige interactie aangaan met
hydrofobe (apolaire) moleculen. Het gevolg hiervan is dat de hydrofobe
moleculen naar elkaar toe worden gedreven. Water wil samen zijn met
andere watermoleculen waardoor het hydrofobe gedeelte afgeschermd wordt van het water.
Opbouw membranen
Membranen kunnen gevormd worden van simpele vetzuren, bv keten van 18 koolstofatomen en een
vetzuurgroep erop kunnen bij een bepaalde pH bilagen vormen. ‘Mogelijke oer membranen’ die een
barrière vormt, maar geen hele sterke barrière. Ze laten kleine moleculen passeren en grote
moleculen niet; selectief membraan. In de vesical reacties waarbij je een groot molecuul verkrijgt die
niet meer naar buiten kan. Deze simpele systemen kunnen fuseren en delen zonder dat er grote
moleculen uit kunnen lekken → dynamisch. Het idee is dus dat zo’n membraan een potentiaal oer
membraan is geweest.
Barrière eigenschappen zijn overgenomen door fosfolipiden met 2 vetzuurstaarten.
Specifieke functies zoals transport overgenomen door eiwitten in membraan. De biologische
membranen nu hebben veel functies met een complexe samenstellen en complexe fysische
eigenschappen. Elk membraan heeft zijn eigen specifieke samenstelling die aangepast is aan de
functie van dat membraan. Kenmerken van membranen:
- Permeabiliteit barrière
- Selectief transport
- Communicatie tussen binnen en buiten
- Energielevering/ opslag
- Grote dynamiek
Cellulaire membranen verschillen in
- Lipide samenstelling
- Transbilaag verdeling
Verschil tussen PM en ER in het membraan: in
plasmamembraan geglycosyleerde lipiden,
sphingomyeline, veel meer cholesterol, in
plasmamembraan PS en PE vooral aan de
binnenkant en SM en PC buitenkant. Bij ER is
de transbilaag verdeling willekeurig.
Het plasmamembraan heeft een
asymmetrische verdeling van fosfolipiden over
de binnenste en buitenste leaflet.
Phosphatidylserine zit alleen maar aan de
,binnenkant (negatief geladen lipiden) als dit aan de buitenkant zit → apoptose signaal.
In het vlak van het membraan kunnen er ook verschillen
zijn. Domeinen in een membraan, bv een domein verrijkt
met cholesterol en sphingolipiden; in dat domein zijn
lipiden meer geordend waardoor die wat dikker is, deze
speciale eigenschappen maken dat speciale eiwitten in dat
domein willen zitten. Hierdoor ontstaat een
concentratiepunt voor specifieke eiwitten met hun
specifieke functie. De laterale eigenschappen van een
membraan zijn dus belangrijk voor hun functie.
Structuur en eigenschappen van lipiden
Skelet van glycerol, op de 1e en 2e plaats vetzuren die
veresterd zijn met verschillende lengte en verzadigingen,
fosfaat veresterd op de 3e plaats met daaraan een
polaire kopgroep (bv. Alcohol). De variatie zit zich dus in
de vetzuurstaarten en kopgroepen. De kopgroepen zijn
allemaal negatief of neutraal geladen, maar nooit
positief! Phosphatidyl choline (PC) moet je de structuur
uit je hoofd kennen (tekenen en beschrijven).
Vetzuursamenstelling heeft ook een grote variatie; altijd een even aantal koolstofatomen (variërend
van meestal 14 tot 24) door de manier waarop ze gesynthetiseerd worden. Geen of wel dubbele
bindingen. Zijn er wel dubbele bindingen, altijd cis-dubbele bindingen → de rest van de ketens
allebei aan dezelfde kant van de dubbele binding liggen. Bij een trans liggen ze tegenover elkaar. Een
dubbele binding vormt een plat vak waarbij ze niet kunnen draaien. Bij een verzadigde keten (geen
dubbele bindingen) is er wel vrije rotatie rond de enkele bindingen (vrije draaibaarheid).
Dit betekent voor een vetzuurstaart met een cis-dubbele binding er een ‘kink’ in zit. De kink in de
vetzuurketen verstoort de pakking; de manier waarop de vetzuurstaarten tegen elkaar aanzitten wat
gevolgen heeft voor de vloeibaarheid. Lipiden zijn vetten en hebben een smelttemperatuur, de
vetzuurstaarten bepalen het smeltgedrag.
Smelten van lipiden (voornamelijk verzadigde lipiden)
Lipiden blijven in een bilaag zitten, maar de vetzuren die gaan smelten. De
vetzuren kunnen bewegingen ondergaan in het vlak van het membraan en dat
gaat 100x zo snel als ze gesmolten zijn. In een gelfase zijn de lipiden erg
geordend en in een vloeibare kristallijne fase (vloeibare fase) niet.
,Bij lage temperaturen zijn de vetzuurstaarten in een “all-trans” conformatie, dit geeft een gunstige
pakking van de ketens naast elkaar. Er is vrije draaibaarheid rond deze C-C bindingen; met dus
verschillende rotatievormen. Sommige draaiingen zijn ongunstiger dan de andere. Als je de
temperatuur gaat verhogen zal het steeds aantrekkelijker voor de vetzuurketen worden om in de
gauche-rotatievorm te zitten (heen en weer springen van trans naar gauche). De single gauche zal
een enorme verstoring in pakking geven en kan niet zomaar gebeuren. Het smelten begint bij het
einde van de keten, omdat daar nog het minst van de pakking wordt verstoord. Als een keten begint
te smelten zal de rest volgen door de verstoring: coöperatief proces.
Vaste fase naar vloeibare kristalllijne fase is een scherpe overgang met
een karaktestieke smeltemperatuur. Lengte en verzadiging van de
verzuurketens zijn bepalend voor de smelttemperatuur van lipiden. Hoe
langer de ketens hoe hoger de smelttemperatuur. Een onverzadigde
binding erbij maakt een gigantisch verschil in smelttemperatuur (lager)
doordat de pakking al verstoort is en dus een lagere smelttemperatuur
heeft.
Eigenschappen van bilagen in gelfase en vloeibare kristallijne fase
- Membranen vormen een efficiente barriere onder en boven de
Tm.
- De dimenies zijn anders: in een gelfase zijn de bilagen dikker en is het oppervlak per
molecuul kleiner. Bij vloeibaar kristallijne fase is het oppervlak per lipiden iets groter door
grotere beweegbaarheid.
Consquentie:
- Pakkingsdefecten bij T=Tm, moleculen kunnn er makkelijker doorheen.
In beide gevallen heb je een efficiente barriere onder en boven de Tm, maar op de Tm niet doordat
de dimensies dus iets anders zijn. De co-excisentie van deze twee fases naast elkaar sluit niet goed op
elkaar aan waarbij het gevolg is dat je pakkingsdefecten hebt op deze faseovergang en moleculen er
makkelijk doorheen kunnen diffunderen (enkele lipiden).
,Hoe zit dit in biologische membranen? Hier heb je een smeltraject; vloeibare fase bij de
groeitemperatuur 37 graden celsius). De vloeibaarheid is belangrijk in biologische membranen.
Je hebt eiwitten die van conformatie moet
kunnen veranderen in zo’n membraan om hun
functie te kunnen uitoefenen. De lipiden
moeten hiervoor vrij vloeibaar zijn. Ook de
laterale beweging van eiwitten;
receptoreiwitten moeten elkaar vinden om
signalen door te geven en moeten kunnen
bewegen. Ook dynamische bewegingen zoals
het afsnoeren van vesicals. Passen organismen
(E.coli) hun lipidensamenstellling aan bij
verandering van omgevingstemperatuur? Ja, bij
een hoge temperatuur krijg je meer verzadigde
lipiden (hebben hogere overgangstemperatuur,
want geen dubbele binding) en minder
onverzadigde vetzuren. Dit is omdat ze de
vloeibaarheid van het membraan gelijk willen
houden.
Rol kopgroepen lipiden
E.coli heeft 3 soorten fosfolipiden:
- phosphatidylethanolamine (PE)
- phosphatidylglycerol (PG)
- cardiolipin (CL/ DPG)
In het schema hiernaast zie je dat de kopgroepen
geen rol spelen in het modeleren in de
vloeibaarheid zoals de vetzuurketens dat wel deden.
De kopgroepen spelen wel een rol in de lading (neutraal of negatief),
negatief belangrijk voor het binden aan positief geladen moleculen.
Lipiden die een relatief kleine kopgroep (cilindrisch lipiden) bevinden
zich in membranen. Vergelijk Phosphatidyl ethanolamine (NH3 groep)
en phosphatidyl choline (N met 3 methylgroepen) met allebei een
positieve lading. Phosphatidyl ethanol amine zal een veel kleinere
kopgroep hebben. Phosphatidyl choline (PC) met een dubbele keten
heeft een cilindrische vorm. Phosphatidyl choline (LPC) met maar 1
keten heeft een kegelvorm en phosphatidyl ethanol amine (PE) heeft
een omgekeerde kegelvorm. Een omgekeerde kegelvorm zal liever niet in
gewone bilagen gaan zitten, maar in gebogen structuur (omgekeerde
structuur als in een micel). In een reageerbuis met water zal phosphatidyl
ethanol amine (of andere kegelvormige lipiden) in een hexagonale fase
gaan zitten. Het zijn lange buizen met in het binnenste water en de
lipiden eromheen met de kopgroep naar het water. Elke buis is omringt
door 6 andere buizen waardoor deze fase hexagonaal heet. Omdat de
buitenkant apolair is en je in water mengt zullen er grote klonten in je
reageerbuisje ontstaan. Deze moleculen zitten wel in onze membranen en
hebben daar een functie:
, - Niet-bilaag lipiden passen goed in sterk gekromde membranen. In kleine
vesicals zullen ze ook goed aan de binnenkant passen; de kromming moet
wel de goede kant op gaan.
- In sterk gekromde oppervlakken komen voor tijdens processen als fusie en
afsnoering van membranen. Membranen komen naar elkaar toe, in een
intermediar heb je erg gekromde structuren; lipiden met een omgekeerde
kegelvorm vergemakkelijken fusieprocessen.
- Samen met bilaag-lipiden kunnen ze ook een vlakke billaag vormen. PE
moleculen kunnen in een bilaag van PC moleculen zitten. Als je een PC
bilaag vergelijkt met een PC met PE bilaag krijgt de membraan andere
eigenschappen. Het hydrofobe effect probeert ervoor te zorgen dat
vetzuurstaarten zoveel mogelijk afgeschermt van het water. Lipiden met een klein kopgroep
zullen de vetzuurstaarten dichter op elkaar gaan
zitten (dichtere pakking in het midden), de
kopgroepen zullen ook dichter naar elkaar toegaan
en hierdoor meer ruimte tussen de kopgroepen in
vergelijking met de PC billaag. Hierdoor zullen
hydrofobe groepen makkelijker binden aan het
membraan omdat het meer “open” ligt door ruimte
tussen de kleine kopgroepen. Door een dichtere
pakking in het midden van het membraan kan het
moeilijker maken voor moleculen om het
membraan te passeren.
Samenvattend → vetzuurstaarten in grote mate bepalend
voor de vloeibaarheid. De kopgroepen zijn in grote mate bepalend voor curvatuur en de manier
waarop de lipiden “gepakt” zijn (laterale drukprofiel; hoe lipiden tegen elkaar aanzitten in een
membraan).
Toepassingen
Liposomen als drug-carriers. Waarom doen we drugs in liposomen? Wateroplosbare drugs kan je
insluiten in een liposoom. Ook vetoplosbare drugs kan je in een liposoom doen. Antilichamen,
polyethyleenglycol (niet gedetecteerd door immuunsysteem) en andere stoffen kunnen chemisch
gekoppeld worden aan lipiden. Grote variatie mogelijk in eigenschappen van liposoom (“tunen” door
specifieke toepassingen).
Voordelen:
- Drugs wordt minder snel geinactiveerd in het bloed,
omdat ze in het liposoom beschermt zijn.
- Niet toxisch, want lipiden zijn lichaamseigen
materialen.
- Targeting mogelijk; naar een bepaald weefsel
- Controlled release mogelijk; kennis over lipiden;
gebaseerd op de permeabiliteits eigenschappen van
het lipiden dat gekozen is, bij een bepaalde pH lek
worden of andere specifieke omstandigheden.
- Mechanisme van opname van lysosoom in cel is
anders dan voor vrije drug; lysosoom via een receptor,
fusie, endocytose.
Maken van lipiden vesicals
1. Lipiden in droge vorm in buisje, dry lipid film.
, 2. Buffer toevoegen.
3. Schudden: door het hydrofobe effect worden spontaan lipide bilagen gevormd in de
vorm van multi-lammellaire vesicals.
4. Vesicals onder druk door filter met poriën van bijv. 200 nm: unilamellaire vesicals met
homogene grootte. Hierdoor heb je kleinere structuren die door de bloedbaan kunnen
(eenlagige vesicals). Hoe? Je hebt 2 spuiten met in het midden een membraan met gaatjes
van 200 nm groot, elke keer door het membraan persen, hierdoor worden de grote vesicals
verbroken door vervorming en worden er kleinere gemaakt die uiteindelijk fuseren en dus
200 nm groot zijn. Door dit een stuk of 20x te doen heb je een homogene populatie van 200
nm vesicals.
Hydrofobe drugs kan je samen met de lipiden in de droge film doen. Hydrofiele drugs voeg je toe
samen met je buffer, hierdoor heb je uiteindelijk wel je drugs aan zowel de binnnen als buitenkant.
5. Drugs aan de buitenkant verwijderen door gelpermeatie chromatografie/dialyse/
centrifugatie.
Covid vaccines; bestaan uit MessengerRNA, coderend voor een van de belangrijke eiwitten in het
virus. mRNA in spuiten in het bloed is het gelijk activeerd, dus niet goed. In het vaccin zit er lipiden;
verzadigd 18:0 phophocholine met cholesterol. In vloeibare membranen ordent cholesterol de
lipiden, maar in gelfase (wat het geval is bij dit lipide) onordent die de lipiden; elastisch maken zodat
het membraan meer kan hebben. Hierdoor is er goede afscherming en aflevering van het Messenger
RNA. Messenger RNA is negatief geladen en bij het lipiden zit er een positieve lading op stikstof. De
positieve lading in het liposoom zorgt ervoor dat het messenger RNA goed gebonden wordt.
Waarop moet je letten als je liposomen gebruikt om geneesmiddelen toe de dienen? Veel
eigenschappen van lipiden die bepalend zijn welk lipiden je gaat selecteren:
- Grootte (200nm/ 800nm)
- Unilamellair of multilamellair
- Barriere-eigenschappen (hele sterke barriere of makkelijk moleculen doorheen diffunderen)
- Vloeibaarheid
- Alleen billaag lipiden of ook niet-billaaglipiden
Tumorweefsel
Tumorweefsel; Medicijn toedienen om uiteindelijk in tumorcellen
terecht komen zodat de tumor gereduceert worden. Tumorweefsel
zelf is meer permeabel dan gewoon weefsel. Liposomen die door
bloedvat stromen kunnen relatief makkelijk door het bloedvat heen
ter hoogte van de tumor. Liposomen bij de tumorcellen zijn er 3
mogelijkheden waarbij de drug in de cellen kan komen.
- Passieve diffusie → voordat het in de cel is het al uit het liposoom lekt en het geneesmiddel
zelf door het membraan diffundeert.
- Endocytose → hele vesical wordt opgenomen in het membraan; al het geneesmiddel komt in
de cel terecht.
