Cel tot molecuul
Thema 1: Het humane genoom en chromosomen
Genoom organisatie
05-11-2016
Nucleotides zijn de bouwblokjes van DNA
Nucleotide= fosfaat + deoxyribose+ base (A, T, C, G)
! Als de fosfaat-groep er niet aan zit heet het een nucleoside
Structuur van een nucleotide: desoxyadenosinemonofosfaat
Hierin zijn de koolstofatomen genummerd (1’, 2’, etc)
5’C-ribose molecuul: zit fosfaat molecuul aan veresterd
Vanwege de OH-groep aan C-atoom 3 is deze vorm
het deoxyribose.
Een DNA-strand:
- De fosfaatgroepen zijn negatief geladen, dus er zou in principe elektrostatische
afstoting zijn, maar;
- Door de waterstofbruggen wordt er toch een hele sterke verbinding gecreëerd tussen
de twee strengen.
Conclusie:
- Twee polynucleotide kettingen: dubbel strengs
- Elke streng heeft een polariteit of oriëntatie: een 3’- en a 5’-einde
- Kettingen zijn anti-parallel in dsDNA
- Strengen worden bij elkaar gehouden bij base paring door
waterstofbruggen
- Strengen zijn complementair in volgorde:
A paart met T (2 H-bruggen)
G paart met C (3 H-bruggen)
- Semi-conservatieve replicatie (een oude en een nieuwe streng)
,In de mens:
- 3 miljard baseparen
- 22.000 genen
- Één DNA-draad is 1 meter lang en 2 nanometer breed
- Weegt 3 picogram (3 x 10−12 ) in de haploïd vorm
- 23 chromosomenparen
22 autosomen (??)
1 geslachtschromosomen (2 verschillende: X of Y)
1 kopie in de kern van een spermacel of eicel (halpoïd)
2 kopieën in het gefuseerde product (zygote, diploïd)
2 kopieën in een somatische celkern (diploïd)
Diameter van een typische kern – 6-8 micrometer
Genoom DNA is verpakt in proteïnen, het complex van DNA en eiwitten heet chromatine.
- Heterochromatine: condensed, transcriptioneel inactief (donkere structuur)
- Euchromatine: decondensed, transcriptioneel actief (lichtere structuur)
Hoe zijn de 2 x 3Mbp DNA verpakt in nucleï/chromatine:
Algemeen:
DNA is negatief geladen door de fosfaatgroep, maar binding ontstond toch via de H-bruggen
en overwint afstoting. Het DNA associeert zich met histonen (eitwitten), deze zijn rijk aan
aminozuren die positief geladen zijn. Het vormt de basale kracht om de DNA moleculen om
histonen te kunnen vouwen:
Meer precies:
- DNA-molecuul windt zich om een kern van histon eiwitten (8 (2x4) histon proteïnen):
vormt een nucleosoom.
- Het resultaat is een soort kralenketting, deze worden verder gecondenseerd door een 5e
histon eiwit. Het vormt een 30nm chromatine fiber.
- De fiber vormt allerlei loops, deze loops gaan condenseren en zo ontstaan er interfase
chromosomen (dat is wanneer ze zichtbaar zijn, maar nog niet heel goed).
- Wanneer een cel in de mitose gaat, volgt er nog een ronde van packaging.
*In de metafase van de mitose is de chromatine in de hoogst gecondenseerde vorm. Je kan
dan goed de losse chromosomen zien.
,Hoe genetisch actiever de cel is (hoe meer transcriptie van meerdere genen) des te meer
euchromatine je aantreft in de cellen!
Het centromeer is een soort ‘inham’ in het chromosoom, de plek waar de twee chromatides
aan elkaar zitten.
Aan het einde van de chromatiden zitten de telomeren.
Chromatide is een van de twee draden in een chromosoom (van P-telomeer tot Q-
telomeer).
In de anafase gaan de twee chromatiden uit elkaar en dan wordt de chromatide weer
een chromosoom (hij blijft dan namelijk alleen).
Classificatie:
Met behulp van de lengte van kortere en langere armen:
- Lage armen: Q-armen
- Korte armen: P-armen (petit = klein)
Met behulp van de positie van het centromeer:
- Metacentrisch: het is moeilijk om de P- en Q-armen
van elkaar te onderscheiden, centromeer ligt in het
midden (onderscheiden mbv ‘barcodes’).
- Submetacentrisch: het onderscheiden van de P-
en Q-armen is makkelijk.
- Acrocentrisch: er ontstaat satellietjes (hele korte
armpje) en lang Q-armen.
Hier bevinden zich genen op de satellietjes die coderen voor het ribosomale RNA.
Met behulp van de lengte van het chromosoom.
Met behulp van G-banding (karyotyping).
- Je maakt metafase chromosomen en die kleur je met Giemsa.
- Er ontstaat een patroon van donkere en lichtere banden op een chromosoom
(barcode achtig idee: zeer nuttig bij metacentrische chromosomen).
- Het geeft een kaart met een lage resolutie van het humane genoom.
- In een geïdealiseerde vorm: idiogram
Zo zijn de genen op het chromosoom in kaart gebracht, er kan dan gekeken worden waar
precies het probleem ligt bij een bepaalde chronische ziekte.
Vb: Cystic Fibrosis lig top 7q31: chromosoom 7, lange arm, regio 3, band nummer 1
X-Chromosoom: Hoge resulutie
- 19 banden G-bandings idiogram
- 153M baseparen
- 2000 genen
Over het algemeen:
- 8M baseparen per band
- 105 genen per band
Dus wanneer er een deletie optreedt dan zitten daar dus vrij veel
genen in. Het is dus belangrijk dat alle genen en waar ze voor
coderen duidelijk in kaart worden gebracht: in welke regio en op
welke band ze liggen.
,Preparatie van het karyotype:
- Cellen die leven:
Bloed lymfocyten ga je stimuleren om te delen.
Huid fibroblasten
Amniocyten (cellen van de foetus uit de amnionholte)
- Je brengt deze cellen in de metafase met behulp van colchicine.
Deze remt de spoelfiguren.
- Cellen op laten zwellen dmv osmose en fixeren met chemicaliën.
- Op een glazen plaatje leggen.
- Kleuren mbv Giemsa, de metafase identificeren: tel en identificeer
de chromosomen .
Wangslijmvlies zijn dode cellen, dus niet geschikt voor chromosoom preparatie, wel is het
zeer geschikt voor het afnemen van DNA.
Naarmate het chromosoomnummer hoger wordt, wordt het chromosoom kleiner. Behalve
chromosoom 22, deze is langer dan chromsoom 21. X-chromosoom is even lang als nr 7.
Het karyogram wordt dus gevorm van chromosomen dit in de metafase
zitten. Je zit dus per nummer 2 chromosomen. Deze bestaan elk weer
uit twee chromatiden. Zie afbeelding
- In de anafase gaan deze twee chromatiden uit elkaar, waardoor
er in de dochtercel twee chromatides krijgen, die nu
chromosomen genoemd worden: een van de moeder en een
van de vader.
Het aantal chromosomen worden in karyotype weergeven:
46, XX, +21
- Eerst het aantal chromosomen
- Daarna geslachtschromosomen
- Numerieke afwijkingen (+ / - )
Sequentie organisatie:
Hoe zijn alle A’s, T’s, C’s en G’s georganiseerd?
Unieke sequenties:
Meeste genen hebben unieke sequenties (voorkomen: 1x in genoom, 2x in somatische cel)
- Een uitzondering: ribosomaal RNA-genen zijn multi- copy
- 100’s of rDNA genen per genoom
- rDNA genen zijn gelokaliseerd op de satellietjes van de 5 acrocentrische
chromosomen.
Repetitieve sequenties (maken substantieel deel uit van het genoot.
- Geclusterd (in tandem repeat, e.g. at centromeres)
De sequenties in een centromeer zijn repetitief, er liggen dus meerdere kopieën,
hierdoor vallen de chromosomen goed te onderscheiden.
- Verspreid tussen genen (voorheen bekend als junk-DNA)
, DNA-sequenties detectie door ‘fluorescence in situ hybridization’ (FISH)
Deze maakt gebruikt van de complementariteit van de twee DNA-strengen in een
dubbelstrengs DNA-molecuul. Je kan DNA tijdelijk
enkelstrengs maken met behulp van een aantal trucs.
- Denaturatie van het dsDNA in gefixeerde cellen:
maken enkelstrengs DNA
- Incubatie met gelabeld DNA-probe:
For a gene locus (typically 100 kB of DNA as
FISH probe)
A centromere (typically a 1-3 kbp: he rep eat size)
A whole chromosome (>47 Mbp)
- Je kunt chemisch fluorescerende moleculen eraan
koppelen je maakt hierbij gebruik van de H-brug
vorming tussen twee complementaire DNA-volgordes
(hybridisatie). Je brengt daarmee een gelabeld gen
probe ‘in situ’ in een morfologisch intact chromosoom in interfase kernen. Je kunt
daarmee genen herkennen op chromosomen.
Je krijgt een indruk van het aantal chromosomen, zonder cellen te kweken.
- Wash and inspect with fluorescence microscope
Dus: met de fish methode wordt het probe-DNA gelabeld.
Monosomie: er is maar een puntje van een bepaalde kleur zichtbaar.
Trisomie: er zijn drie puntjes van dezelfde kleur zichtbaar.
Sequentie: volgorde van A’s, T’s, G’s en C’s
VCFS: deletie van een stukje DNA op 22q….. waardoor de patiënt een bepaald fenotype
krijgt. Bij de FISH-methode zie je dan geen tweede rode puntje.
Array comparative genomic hybridization: losses and gains of DNA detected over the full
genome.
- Je hebt dubbelstrengs DNA -> target DNA laat je hybridiseren met een sequence die
complementair is aan dit DNA.
- Van elk segment van het genoom wordt een stuk DNA genomen en deze wordt
gespot op een RE
- Het DNA van de patiënt zelf wordt gelabeld en niet het probe-DNA.
Techniek waarmee je het hele genoom op deleties of duplicaties of andere applicaties kunt
analyseren.
Dus labellen:
- Karyotyping
- FISH
- Array comparative genomic hybridization
- (NextGen Sequencing)
