Moleculaire Diagnostiek 2
Boek: Molecular Diagnostics, Fundamentals, Methods and Clinical Applications (hst. 10 t/m 14)
Boek: Rijkers Immunologie (hst. 5, 8 en 15)
Inhoudsopgave
Chapter 10 DNA polymorphisms and Human identification...................................................................3
Technieken.....................................................................................................................................4
Chapter 15 DNA-based Tissue Typing.....................................................................................................6
Structuur en functie van MHC............................................................................................................7
HLA genen: transplantatie..................................................................................................................8
HLA nomenclatuur:.........................................................................................................................8
Diagnostiek.....................................................................................................................................8
Inherited diseases...................................................................................................................................9
Mutatie naamgeving.....................................................................................................................10
Hoe onderzoeken we de genetische mutaties?: Sequencen............................................................10
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)..............................................................10
De techniek MPLA.........................................................................................................................10
Familiair borst/ ovarium carcinoom.............................................................................................12
Factor V-leiden.............................................................................................................................13
Prader Willi syndroom (PWS) en Engelman syndroom (AS)..........................................................14
Methylerings specifieke MLPA..........................................................................................................15
Chapter 11 Micro-organisms................................................................................................................16
Moleculaire detectie van micro-organismen....................................................................................16
Micro-organismen........................................................................................................................16
Gastcollege Prof. Niesters: Virologie....................................................................................................18
Gastcollege Prof. Schuuring: Moleculaire oncologie............................................................................18
Moderne technieken moleculaire pathologie......................................................................................19
MassArray analyses......................................................................................................................19
Droplet digital PCR (ddPCR)..........................................................................................................21
Chapter 14 Molecular Oncology...........................................................................................................21
Genetische veranderingen in tumoren; oncogenen en tumor repressor genen...............................21
Raf................................................................................................................................................22
Chapter 13 Molecular oncology............................................................................................................23
Hoofdstuk 15 Hematologische maligniteiten (Rijkers)..........................................................................24
Herrangschikking van genen.........................................................................................................25
Monoklonale ontsporingen..............................................................................................................25
, Folliculair lymfoom; Bcl-IGH.........................................................................................................26
Opdrachten en vragen..........................................................................................................................26
Afkortingen...........................................................................................................................................28
,Chapter 10 DNA polymorphisms and Human
identification
Er is veel variatie in DNA tussen mensen, dit omdat 98% van het DNA niet codeert voor genen.
Ongeveer elke 1000 tot 1500 baseparen in het genoom is verschillend, dit zijn Single Nucleotide
Polymorphisms (SNP’s). Naast de SNP’s zijn er verschillende repeterende stukken DNA waarvan
iedereen een ander aantal repetities heeft. Deze zijn ook belangrijk voor identiteitsbepaling.
Waarom doen we identiteitsbepalingen?
Forensische vraagstukken;
- Is het gevonden DNA van de verdachte?
- Niet te identificeren menselijke resten
- Oude graven
Klinische vraagstukken;
- Is het monster wel van patiënt A
- Testen van donoren voor bijvoorbeeld orgaandonatie
- Testen van o.a. T-cellen na beenmergtransplantatie
Persoonlijke vraagstukken;
- Wie is mijn vader?
Vroeger werd er vooral gekeken naar polymorfe eiwitten zoals ABO en rhesus, HLA, polymorfe eiwit
systemen. Uiteindelijk zijn er slechts 10 polymorfe eiwit markers, hiermee is een nadeel dat het
onderscheidend vermogen 1 op 1000 is. Ook zijn biologische ‘sporen’ onbruikbaar.
Nu wordt er gekeken naar DNA:
DNA profiel > SDR analyse, info over kleine stukjes van het DNA van een individu
Databank > DNA databank het NFI
De informatie wordt bewaard als een digitaal profiel en biologisch materiaal.
Wat zijn de genetische verschillen tussen mensen?
HLA (DNA)
VNTR, variable number tandem repeats
STR, short tandem repeats
RFLP, restriction fragment length polymorfisms
SNP, single nucleotide polymorphisms
Repetitief DNA
Het niet coderend DNA bevat veel (40%) repetitief DNA.
Minisatteliet DNA: repeats met ‘blokjes’ van 10 tot 60 basen: VNTR’s, deze zijn te detecteren met
restrictie enzymen en southern blot.
Microsatteliet DNA: repeats met ‘blokjes’ van 2 tot 10 basen: STR’s, deze zijn te detecteren op
verschillende plekken in het genoom. Gevoelig voor mutaties en aantal repeats. En daarom zeer
geschikt voor identificatietechnieken. De STR’s zijn te detecteren met PCR.
,Technieken
RFLP
Een oude techniek om verschillen in DNA aan te tonen. SNP’s zijn verantwoordelijk voor het
introduceren of verwijderen van een restriction site. Door meerdere restriction-sites te ‘mappen’ kan
een DNA profiel gemaakt worden. Het RFLP is een techniek gebaseerd op Southern blot.
Door middel van RFPL zijn bijvoorbeeld bepalingen te doen of mensen gerelateerd aan elkaar zijn.
STR
Een meer gevoelige methode waarbij er gebruik gemaakt
wordt van PCR, de VNTR’s zijn hier te lang voor. STR’s zijn kort
(repeat unit 1-7 bp) en geschikt voor PCR (100-400 bp).
De voordelen van de methode zijn:
Minder DNA nodig omdat PCR toegepast kan worden
Minimaal 10 ng in plaats van 100 ng DNA nodig
Kleinere stukken is geen probleem
Veel sneller, 24-48 uur in plaats van 5-7 dagen
Multiplex
STR op gel is bijna niet te doen, dus wordt er gebruik gemaakt van een capillaire
elektroforese.
Er zijn voor tientallen STR primers verkrijgbaar. De naam van de STR zegt iets over de locus of de plek
op het chromosoom. Bijvoorbeeld:
- CD4; locus tussen CD4 en triosephospate isomerase
- D13S317; chromossom 13, segment 317
Naast de STR’s wordt er een extra locus meegenomen, dit is
amelogenine locus (geen STR). Dit gen codeert voor tand maturatie
en is te vinden op het x- en y- chromosoom. Het y-allel is 6
baseparen langer dat het x-allel, dit zorgt dus voor 2 pieken bij de
man en 1 bij de vrouw.
CODIS is het combined DNA indexing system. Er zijn 20 STR loci voor het bepalen van het DNA
profiel. In Europa wordt het ESS gehanteerd met 12 loci. De hoeveelheid loci nodig is een
ingewikkelde vraag, sommige allelen komen vaker voor dan andere.
Voor de STR bepaling wordt in Europa de NGM kit gebruikt. Dit is een standaardisatie in de
diagnostiek: Next generation STR kit. Dit is een multiplex PCR op 15 STR loci plus de sekse-specifieke
PCR. De gebruikte primers hebben een fluorescent label.
De verschillende STR’s
ALU gen
In al het DNA aanwezig, hiermee kan de hoeveelheid aanwezig DNA gemeten worden.
Y-STR, Y-chromosoom specifieke STR-loci (6-20 stuks)
Een Y-specifiek STR-loci. Er is onderscheid te maken tussen sperma en epitheel DNA zonder
,scheidingsstappen. Het is geen recombinatie gen, dus overerving is 100%. Het Y-chromosoom wordt
alleen doorgegeven via de mannelijke lijn, dus er is geen verschil tussen de broers, vaders, zonen.
Mitochondriaal DNA
Mitochondriaal DNA wordt voornamelijk overgeërfd via de moeder-lijn. Met het mitDNA zijn
biologische sporen materiaal zonder kernhoudende cellen, bijvoorbeeld haren of oude skeletresten.
Er zijn twee hypervariabele regionen in het mitochrondriaal DNA. De regio wordt gePCR’ed en dan
gesequenced.
STR bepaling: beenmergtransplantatie
Een belangrijke toepassing bij bepaalde leukemieën. Het doel is het bepalen of de cellen van de
donor echt tot ontwikkeling komen in de patiënt.
Dit door voor de transplantatie het DNA profiel van donor en patiënt te bepalen. Na transplantatie
wordt het DNA profiel van de witte bloedcellen van de patiënt gevolgd (hier moet je het DNA profiel
van donor in terug vinden). Dit geeft informatie of de transplantatie is gelukt en is een indicatie dat
de patiënt niet of nauwelijks tumorcellen meer aanmaakt.
Opdracht beenmergtransplantatie !tentamenstof!
1. Wat is chimerisme?
Chimerisme is de verhouding donorcellen-eigen cellen.
2. Hoe kan het dat er een bepaalde verhouding eigen cellen/donorcellen is bij patiënten?
Het verschilt over tijd na de transplantatie. Er zullen eerst nog eigen bloedcellen aanwezig zijn, bij een
geslaagde transplantatie zal het percentage eigen bloedcellen dalen en donor bloedcellen stijgen.
Een chimerisme van 60 procent betekent dat 60 procent van de bloedcellen van de donor is, en 40
procent de oorspronkelijke eigen bloedcellen zijn.
3. Waarom wil je dit meten bij een patiënt?
Voor een indicatie over het verloop van de ziekte. Wanneer de hoeveelheid aanmaak eigen
bloedcellen weer oploopt duidt dit op terugkomst van de ziekte.
4. Welke loci worden bepaald met de Powerplex HS 16 kit?
Zijn dit allemaal STRs?
De 15 STR loci (tabel) en amelogenine. Het amelogenine is
geen STR, dit is een gen dat bij iedereen aanwezig is.
5. Hoeveel loci worden gebruikt voor het bepalen van het
chimerisme?
2 verschillende loci, welke het beste infomatie geven over de
donor vs patiënt
, 6. Leg uit wat met DOP bedoeld wordt
Donor Overlap Patiënt, de donorpieken worden weergeven met ‘D’, overlap van donor en patiënt met
‘O’ en patiëntenpieken met ‘P’. Indien de aanwezige stutterpieken een overlap hebben met donor of
patiënt, dan worden deze ook meegenomen in de DOP code.
7. Hieronder het resultaat van de screening voor D16S539. Is deze informatief? En waarom ja of
nee?
Wanneer DOP code toegepast: ODP. Dus is informatief want er zijn losse pieken te zien.
8. Hieronder het follow up resultaat van een patiënt (zelfde locus als hierboven). Met behulp van
paragraaf 10.10 (berekening) kun je het % chimerisme bepalen. Bereken het % donor in het bloed
en in de T-cell fractie.
16413 D, 4616 P.
Volbloed: (16413/ (16413 + 4616) * 100 = 78% donor
T-cel fractie: 15608 / (15608 + 516) * 100 = 96,8% donor
Volbloed: 4616/ (16413 + 4616) * 100 = 22% patiënt
9. Als controle worden 2 mengsels meegenomen, een 5% donor-95% patiënt en een 50% donor-
50% patiënt mengsel. Zie hoofdstuk 12 van de SOP. Leg uit waarom deze mengsels worden
meegenomen in de diagnostiek.
Uit onderzoek is gebleken dat er een reproduceerbaar verschil kan zijn tussen de resultaten van de
verschillende loci binnen één patiënt. Dit is te verklaren door een mogelijke preferentiële amplificatie
van één van de allelen van donor of patiënt (pre-allo).
10. Hiernaast het follow resultaat van een 32 jarige vrouw. Boven: pre-
transplantie patiënt. Midden: donor. Onder: 1 jaar na transplantatie patiënt. Is
de transplantatie succesvol geweest?
Ja, er is een goot percentage: (40704/(40704+3171))*100% = 92,3% aan
donorcellen.
Voor chimerisme bepaling wordt op zoek gegaan naar 2 informatieve loci. Door de
repeats in zo’n allel kunnen er ‘stutters’ ontstaan bij de PCR.
Chapter 15 DNA-based Tissue Typing
DNA-based tissue typing gaat op basis van de MHC/ HLA (is hetzelfde eiwit).
