Samenvatting moleculaire biologische technieken. MBT. Wilson and Walker, Principles and Techniques of biochemistry and molecular biology, 8th edition. Campbell and Farrel, Biochemistry, 8th edition. Alberts et al, Molecular biology of the cell, 6th edition,
Waarom PCR? Aanwezigheid van een gen of andere sequentie aantonen
- TEK (kolonie PCR op UVRC gen)
- MBE (kolonie PCR op H2B gen)
- Identificatie van mo
- Identificatie van personen en forensisch onderzoek
Forensische PCR
Een piek in het DNA profiel (DNA sequentie) homozygoot
2 pieken in het DNA profiel (DNA sequentie) heterozygoot
Proces PCR en analyse
- PCR
- Agarose gel electrophoresis
- UV visualisation
- The final product
Promotor, gen of andere genetische onderdelen kloneren
DNA polymerase beweegt over het DNA van 3’ 5’
DNA polymerase maakt het DNA van 5’ 3’
Doel van PCR specifiek stuk DNA in vitro te kopiëren (amplificeren)
Proces DNA replicatie
,Waarmee maak je een PCR reactie specifiek? In de DNA replicatie maakt Primase
RNA primers
Verschillen replicatie vs PCR
Replicatie PCR
Helicase Denaturatie (hoge temperatuur 96
graden)
RNA primers Artificiële DNA primers (Oligo’s)
37 graden 72 graden met Taq Polymerase
(bacterie waar het enzym in zit groeit
in gijzers, overleeft hele hoge
temperaturen (werkt het beste bij 72
graden)
PCR reactiemengsel;
- DNA (template)
- Twee primers (forward en reverse)
- Nucleotiden
- Tag polymerase
- Buffer
PCR wat heb je nodig?
- Forward en reverse startpunt DNA polymerase
- Nucleotiden bouwstenen DNA
- KCl monovalent cation (K+) voor optimale binding primers
- Tris buffer voor optimale pH voor enzym
- MgCl2 divalent cation als cofactor voor enzym
- DNA polymerase Enzym dat DNA repliceert
- 102 -105 kopiën DNA template DNA dat geamplificeerd wordt
PCR stappen; 1 PCR cyclus (30-40 keer herhalen)
- Denaturatie (uitsmelten) 90-96 graden dsDNA wordt ssDNA, 15 s – 30 s
- Annealing (hybridisatie primer) 50-65 graden primers binden op ssDNA,
15 s – 30 s
, - Extensie (elongatie door polymerase) 72 graden DNA wordt verdubbeld ,
30 s – 5 min (hoe groter het stuk is dat gekopiërd moet worden, hoe meer
tijd je nodig hebt)
- DNA synthese , 72 graden , 10 min
- 30-40 x herhalen
Na een cycli heb je 2n keer zoveel materiaal (30cycli ; 109 keer zoveel)
Primers ontwerpen
Annealen van primers
- Primers (oligo’s ) korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nt)
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie te maken
- Specifiek
Stel een primer is gatg (4nt lang)
Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
Dan moeten de 1e, 2e en de 3e en de 4e base passen
De kans hierop is ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (1/4)4 = 1/256
Dus de primer bindt statistisch 1 om de 256 basen
Een DNA fragment van 1000 bp heeft dan ongeveer 4 bindingsplaatsen voor deze
primer (1000/256=4)
Stel een primer is 20 nt lang. Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
De kans hierop is (1/4) 20 – 1/( 1 1012) basen
Dus een primer van 20 nt lang komt in 1 per 1*10 12 basen voor
Humane genoom ; 3*109
Willekeurige primer van 20 nt kan statistisch minder dan 1 keer in het humane
genoom binden
Forward primer, dezelfde sequentie als begin
Reverse primer, reverse complementair
Algemene regels voor primer design
-3’ – end G of C (binding is sterker, 3 waterstofbruggen)
-17-28 bp
-40- 60 % GC
-voorkom primer dimeren (anders bindt forward en reverse primer aan elkaar, ipv
aan template DNA)
-voorkom interne ‘self-annealing) anders hairpin
-Tm tussen 50 en 70 graden wanneer 50 % van de primer nog bindt aan target
sequentie
Wordt gemeten door fluorescerend molecuul dat bindt aan enkelstrengs ( of
DS??.. ) DNA
Smelttemperatuur (Tm) = Wanneer 50 % ssDNA en 50% dsDNA is
Smelttemperatuur berekenen;
Tm = 2(A+T) + 4(C+G)
Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Laagste Ta = temperatuur die je in de PCR reactie gebruikt
, Wat kan er gebeuren als er een lagere temperatuur wordt gebruikt bij annealing
primer wordt aspecifiek, bindt op verkeerde sequentie (Base), kunnen andere
PCR producten ontstaan
Taq DNA polymerase Thermus aquaticus (optimum synthese temperatuur 72
graden)
-Hitte stabiel
-Geen proofreading activiteit
-1 kb/min
Proofreading wanneer er een foute base wordt ingebouwd tijdens polymerase,
wordt er dmv hun 3’ 5’ exonuclease activiteit zelf verwijderd dmv polymerases.
Niet alle polymerases hebben proofreading activiteit (bv Taq)
Bronnen template DNA (RNA) (monster)
-klinisch, forensisch, aarde, platen ,fossielen
Template DNA; voorwaarden voor in PCR reacties
-meestal wordt DNA gezuiverd (je weet dan zuiverheid en hoeveelheid)
-Geen remmers van DNA polymerase ( bijvoorbeeld heem groep in hemoglobine,
humuszuur in aarde)
-target bereikbaar voor primers en Taq
-Geen EDTA (of hele lage concentratie; Mg2+
-niet teveel fragmentatie/afbraak
-niet te vaak vriezen/ontdooien
Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën
MBT-hoorcollege Kloneren
Hoe kloneer je een PCR-product? Primers ontwikkelen, primers bevatten extra
sequentie wat niet bindt aan stuk DNA van interesse.
De 5 stappen van het kloneren
- Restrictie-enzymen knippen
- Ligase plakt
- Vectoren
Waarom kloneren? Manipuleren van DNA om eiwit in grote hoeveelheden te
produceren, functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken, effect
van gen mutanten bestuderen.
Promotor kloneren luciferase uit fruitvliegje
5 stappen kloneren:
- Digestie: DNA (plasmide of een PCR-product) met RE knippen
- Ligatie: DNA fragment in het plasmide inbouwen recombinant
- Transformatie: de plasmiden worden opgenomen door de bacteriën
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper aliciadekr. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €2,99. Je zit daarna nergens aan vast.
