GKA
Gentherapie en kanker, DT1
Transcriptie en translatie
Vaccin tegen kinkhoest is nog niet optimaal. Veroorzaker is net anders dan dat wat er in het
vaccin zit.
Promotor = plaats waar RNA polymerase landt.
Eukaryote transcriptie is afhankelijk van meerdere DNA sequenties naast de promotor. 1500
genen zijn betrokken bij transcriptie. TBP (TATA-box binding protein) buigt het DNA en
markeert zo de plek waar RNA polymerase landt voor transcriptie start.
Affiniteitschromatografie met suikerbolletjes die GC sequenties bevatten werden in cel
extract geplaatst. Het eiwit Sp1 (specificity protein 1) bindt aan de bolletjes. De
gedachte was dat genen met een GC-box ook dit eiwit zouden binden en dat
transcriptie gestimuleerd zou worden. Daarnaast werd er gedacht dat Sp1 zou binden
aan TBP, maar dat doet het niet. Sp1 bevat drie zink-vingers: een AZ sequentie met
vier cysteïnes en/of histidines die zodanig bij elkaar zitten dat ze een zink atoom
vasthouden. Loop bindt aan DNA. Daarnaast heeft Sp1 een erg glutamine-rijk
domein, waarmee het bindt aan andere eiwitten (co-activatoren of mediator eiwitten).
Sp1 bindt als dimeer aan het DNA. Het glutamine-rijke domein is het transactivatie
domein, waarmee Sp1 een ander eiwit (co-activator) trans activeert. Sp1 is een
activator.
TATA-box is onderdeel
van de promotor en wordt
gebonden door TBP. Basale
transcriptie factoren zijn nodig
voor de basis transcriptie. Als
alleen basale TF aanwezig zijn
kan RNA polymerase wel
binden en transcriberen, maar
de efficiëntie is heel erg laag.
Transcriptie efficiëntie gaat heel
erg omhoog bij activatie door
binding aan co-
activatoren/mediator eiwitten
die zelf niet aan het DNA
binden (TF zonder DNA bindend domein). Co-activatoren en mediator eiwitten binden aan
activatoren (zoals Sp1, 1500 verschillende). Enhancer sequentie heeft alleen betekenis als
de activator aanwezig is, verschillend in verschillende celtypen: reguleert genexpressie.
TBP is onderdeel van TFIID. Enhancer sequentie zit minstens 100 bp verwijderd van de
promotor en kan heel ver weg zitten (miljoen bp). Silencer sequenties binden een repressor
eiwit, deze kan competeren met de binding van een activator en zo genexpressie remmen,
maar de repressor kan ook een negatieve invloed op co-activatoren uitoefenen. Transcriptie
begint niet bij het coderende gebied, er is altijd eerst een stuk mRNA dat niet wordt omgezet
naar AZ (5’ UTR).
,Activatoren binden aan enhancers, wat leidt tot de binding van co-activatoren. Co-activatoren
trekken basale TF en RNA polymerase aan. Nucleosomen moeten aan de kant.
De kleine subunit van een
ribosoom bindt aan het initiator
tRNA (Met) en het mRNA. mRNA
wordt herkent door een cap-binding
protein (eIF-4E). Complex moet
vanaf de 5’ kant gaan scannen tot
het het startcodon vindt. Alle
initiatie factoren vallen er daar af
en de grote subunit van het
ribosoom bindt.
Nieuwe genetische medicijnen
Bij gentherapie worden cellen van een
patiënt afgenomen, deze cellen worden
behandeld met een vector (virus)
waardoor de cellen een eigenschap
krijgen die ze eerst niet hadden, de cellen
worden vervolgens opgekweekt en
teruggegeven aan de patiënt.
Naast gentherapie bestaan er meer
genetische therapieën.
Triplex strategie → blokkeert transcriptie (van een ziekmakend eiwit)
Antisense therapie → blokkeert translatie
Bij de triplex strategie wordt transcriptie geblokkeerd door een nucleotide sequentie
(oligonucleotide), dat bindt aan het DNA. Door binding vormt een triplex en wordt transcriptie
geblokkeerd. Bij antisense therapie bindt een antisense molecuul aan mRNA waardoor
translatie wordt geblokkeerd. Antisense betekent dat het molecuul complementair is aan het
sense mRNA (sense = positief strengig, antisense = negatief strengig).
Een DNA-oligonucleotide is ongeveer 16-20 nucleotiden lang. Een gen is een
aantal honderdduizend baseparen. Genoom bevat 6 miljard nucleotiden en
dus 3 miljard unieke nucleotiden. Als een oligo 16 nucleotide lang is, met 4
opties per positie, zijn er 4^16 = ongeveer 3 miljard opties. Als een oligo 16 nt
lang is, is die uniek voor 1 plek in het genoom en zal het alleen baseparen
met het gewenste gen.
ASO = antisense oligo.
Nucleotiden zijn erg kwetsbaar en negatief geladen. Elke nucleotide heeft
1/1,5 negatieve lading. Deze negatieve lading wordt opgeslagen in positief
geladen histonen en kationen. Door deze negatieve lading komt een oligo erg moeilijk de cel
in. DNase en RNase komen ook overal voor. Om deze twee obstakels te overbruggen zijn
modificaties nodig:
• Oligo worden minder negatief geladen gemaakt, waardoor de hydrofobiciteit afneemt.
, o Negatief geladen zuurstof atoom in fosfaatgroep van nucleotide vervangen
door een zwavelatoom of een methylgroep.
o Methoxyethyl groep kan aan de 2’ van een nucleotide geplaatst worden
waardoor het minder geladen wordt.
• Als het oligo gemodificeerd wordt, neemt dat kans dat het gekliefd wordt door een
Dnase of RNase af.
• Opname in de cel neemt toe.
Morfolino → veel voorkomende
gemodificeerd type oligo
• 6-ring ribose
• Ribose bevat een stikstof
• O in fosfaat is vervangen door een
aminogroep
Veel minder gevoelig voor DNase en
RNase en daarmee stabieler, wordt veel
beter opgenomen door verlaagde
hydrofobiciteit. Veel duurder om te
maken.
Als een morfolino wordt gericht op/antisense is aan het deel dat in het 5’ UTR (of in het
gebied rond de AUG) ligt is de efficiëntie van remming van translatie veel hoger dan wanneer
de morfolino antisense is aan het coderende deel van het mRNA op afstand van AUG. Dit
komt omdat het ribosoom gevoeliger is voor remming op het moment dat het aan het
scannen is dan op het moment dat het aan het vertalen is. Complete ribosoom is in staat om
morfolino van mRNA af te gooien (uitsmelten van secundaire RNA structuren).
Bij de triplex strategie basepaart een oligo
met de DNA helix en vormt zo een triplex.
De stabiliteit van een driestrengige
structuur is echter alleen groot genoeg als
het bestaat uit een lange reeks van alleen
A-T baseparing. Een oligo tegen een
willekeurige sequentie is dus niet stabiel
genoeg.
Een oligo kan expressie (in theorie)
dus blokkeren als bij transcriptie, door
de vorming van een triplex. Of bij
translatie, door de binding van een
antisense oligo dat het ribosoom
blokkeert. Daarnaast vormt door
binding van een antisense oligo lokaal
een dubbelstrengs deel RNA, dat
herkent wordt door ribonuclease H
(RNase H), het mRNA breekt
waardoor er geen eiwit wordt gevormd.
, Hoe goed het antisense RNA basepaart met de mRNA bepaalt op de oligo alleen translatie
blokkeert of ook mRNA degradatie induceert.
Antisense ligt aan de basis van RNAi, unieke manier om een specifiek gen uit te schakelen.
siRNA is afkomstig van precursor RNAi dat gecodeerd ligt in ons genoom.
Genetische therapieën: Gen therapie
Een vector is een middel om DNA over te brengen. Vaak wordt een virus gebruikt.
ADA-SCID → adenosine deaminase-severe combined immunodeficiency
Gen therapie gebruikt genen, die het vaakst geïnserteerd worden in een virus vector, om
ziekte symptomen te behandelen of voorkomen. Verandering in fenotype, genetisch
materiaal mag niet veranderd worden.
Hematopoëtische stamcel is de stamcel vanuit
waar alle bloedcellen gevormd worden. Deze
stamcel differentieert in een lymfoïde en een
myeloïde tak. Uit de common lymfocyte
precursor vormen NK cellen, T cellen en B
cellen. Bij ADA-SCID wordt deze laatste
differentiatie geblokkeerd.
De mol massa van een AZ is 100 dalton. In
een eiwit van 38 kDa zitten 380 AZ.
ADA (adenosine deaminase) zet adenine om
in inosine, inosine is belangrijk bij de
metabolisme van nucleotiden. Inosine is een precursor van nucleotiden. Purine metabolisme
is nodig voor DNA replicatie. Per seconde worden erg veel immuuncellen gemaakt, ADA-
SCID heeft dus een groot effect op het immuunsysteem.
Bij Ashanti DeSilva werd op 4 jarige leeftijd adulte T cellen uit haar bloed genomen, waar
met behulp van een retrovirus het ADA gen in geplaatst werd (cellen zijn getransduceerd met
een recombinant retrovirus). Deze cellen werden opgekweekt en terug geplaatst. Ze werd
nogsteeds daarnaast geïnjecteerd met een vorm van het enzym, gekoppeld aan PEG voor
stabiliteit (reguliere behandeling).
Bij gentherapie is het virus zo aangepast dat
genen van het virus die ziekmakend kunnen zijn
weggenomen worden, en het therapeutisch gen
in het virus geplaatst wordt. Deze recombinante
vector maken na infectie van een cel
therapeutisch eiwit i.p.v. virus eiwit. Het virus
mag niet meer in staat zijn om te repliceren.
