Samenvatting B04 BLT
Junqueira’s Functionele Histologie
Hoofdstuk 1: Waarnemingsmethoden
Weefselvoorbereiding
Alleen dunne coupes van weefsel zijn doorgankelijk voor licht. Om dunne coupes te kunnen
maken worden weefsels eerst gefixeerd en in een snijdbaar materiaal ingebed.
Coupes = wordt met een microtoom gesneden, worden gekleurd (hebben van nature te
weinig contrast om ze direct te kunnen bestuderen)
Indozen = na het uitsnijden het weefsel overbrengen in doorvoercassettes
Fixatie
Fixatie = stopt het metabolisme (autolyse) van cellen en weefsels, legt de structuur vast
en bereidt voor op de daaropvolgende behandelingen. Vorming van artefacten
voorkomen.
Fysische fixatie = fixatie dmv bevriezing, omdat cellen en weefsels veel water bevatten
komen alle celprocessen stil te liggen. Ook is ingevroren weefsel voldoende hard om er
coupes van te kunnen snijden.
Nadeel: door ontstaan ijskristallen beschadigt het weefsel en na ontdooien geeft dit
krimp en kan er gaten in het weefsel ontstaan. Dit wordt (deels) voorkomen door het
weefsel heel snel in te vriezen (bijv. vloeibare stikstof), er is dan onvoldoende tijd voor
de watermoleculen om een kristalrooster te vormen.
Chemische fixatie = denatureert eiwitten, onder andere door ‘crosslinking’ waarbij
enzymen onwerkzaam worden, maar autolyse voorkomen wordt (autolyse zorgt voor
verval van structuur in een weefsel nadat het uitgenomen is of van zijn fysiologische
ondersteuning ontdaan is), gebeurt bij voorkeur op zeer vers weefsel
2 groepen fixatieven:
1. Coagulerende: er wordt water uit het weefsel onttrokken en
denatureren/coaguleren de eiwitten. Watermantel rond moleculen valt weg,
eiwitten kunnen geen waterstofbruggen meer vormen met de watermoleculen.
Hierdoor slaan de eiwitten neer en plakken deze aan elkaar
bijv. aceton, methanol, ethanol (70-100%), chloroform, azijnzuur (maximaal
5%)
2. Niet-coagulerend (cross-linkend): er worden covalente bindingen gevormd,
hierbij vormt het fixatief een brug tussen de macromoleculen waaruit het weefsel
is opgebouwd. Fixatietijd is 24-48 uur, bij langere fixatietijden bestaat de kans op
overfixatie (teveel crosslinks in het weefselen het weefsel wordt hierdoor harder.
bijv. Formaline (formaldehyde gas in water), reageert met reactieve groepen
uit het weefsel: aminogroepen -NH2 (komen veel voor op eiwitten en
nucleïnezuren, -COOH, -OH, -SH, fenyl van aminozuren (eiwitten), -C=C- in vetten
en -NH2, -OH, -PO4 in nucleïnezuren. Koolhydraten als glycogeen en neutrale
, suikers bevatten geen reactieve groepen welke met formaldehyde kunnen
reageren
Immersie = stukje weefsel wordt in het fixatief ondergedompeld
Perfusie = via de bloedvaten van het orgaan. Levert betere resultaten door de snelle,
directe inwerking van het fixatief op de cellen en de extracellulaire matrix
Inbedding
Doorvoeren = weefsel is niet voldoende hard om er dunne coupes van te kunnen
snijden. Door het water er uit te halen en te vervangen door paraffine is het weefsel
wel voldoende hard.
Stappen doorvoeren:
1. Ethanol (verangt water in alle cellen)
2. Xyleen (lost alcohol op)
3. Paraffine (verplaatst xyleen)
Voor de inbedding wordt er gedehydreerd (ontwateren) om de paraffine in het
weefsel te kunnen laten doordringen. Dit gebeurt geleidelijk omdat er kans op krimp,
scheuren of verschrompeling bestaat wanneer het water te snel aan het weefsel
wordt onttrokken.
Dehydratie = oplopende alcohol (meest gebruikt) reeks (50%, 70%, 80%, 96%, 100%),
elke stap duurt 30-60 minuten, meestal worden de stappen 1x herhaald
Ophelderen: Omdat het polaire ethanol (100%) en de apolaire paraffine niet
mengbaar zijn, wordt xyleen als tussenstof/intermedium gebruikt. Hierdoor worden
de weefselstukjes helder en doorzichtig.
Impregneren met het inbedmedium: intermedium (xyleen) wordt vervangen door
een vloeibaar inbedmedium. Wanneer de temperatuur van de paraffine te hoog is
(>60°C) gaan er structuren van het weefsel als gevolg van hitte denaturatie verloren.
Doorvoermachine wordt vaak ’s nachts gebruikt omdat dir ca. 8-10 uur duurt.
Voorbeeld doorvoerprotocol
Nr. Stap Tijd
0 formaline Tot de start van het doorvoeren
1 Ethanol 50% 30 minuten
2 Ethanol 70% 45 minuten
3 Ethanol 70% 45 minuten
4 Ethanol 80% 45 minuten
5 Ethanol 80% 45 minuten
6 Ethanol 96% 45 minuten
7 Ethanol 96% 45 minuten
8 Ethanol 30 minuten
, absoluut
9 Ethanol 45 minuten
absoluut
10 Ethanol 45 minuten
absoluut
11 Xyleen 45 minuten
12 Xyleen 45 minuten
13 Paraffine 60°C 45 minuten
14 Paraffine 60°C 45 minuten
15 Paraffine 60°C 60 minuten
Wanneer na afloop van de doorvoerreeks de weefselstukjes volledig zijn
doordrongen met paraffine, kan er worden ingebed.
Het weefsel wordt in een passende inbedmal geplaatst met een beetje vloeibare
paraffine. Hierbij wordt nagedacht over de juiste oriëntatie. Vervolgens wordt de
cassette op de mal geplaatst (identificatie) en wordt de mal verder aangevuld met
paraffine. Tot slot wordt de mal geplaatst op een koele plaat, het snel laten stollen
van paraffine voorkomt vorming van paraffine kristallen en verbetert de
snijdbaarheid van het blokje. Na enige tijd kan de mal eraf worden gehaald en is het
paraffineblokje klaar om gesneden (4 µm dik) te worden.
Paraffinecoupes worden op een microtoom gesneden tot coupes van 5 µm voor LM
Coupes worden op een preparaatdrager/microscoopglaasje gebracht en gekleurd of
gecontrasteerd met verschillende middelen.
Kleuren
Histologische kleuring = kleurstofbinding vindt plaats op basis van een interactie
tussen het weefsel en de kleurstof; aantrekkingskracht tussen + en – lading
(ionbinding), H-bruggen, hydrofobe interacties en VDW binding.
bijv. Haematoxyline, eosine, van Gieson en Alcian Blue
Histochemische kleuring = kleurstofbinding vindt plaats op basis van reactie;
kleurstof zal covalente binden aan weefsel (PAS) of neerslag vormt zich op weefsel
(reticuline kleuring volgens Gomori)
bijv. PAS (neerslag vormt op weefsel)
Basofiel = weefselonderdeel dat een hoge affiniteit heeft voor basische kleurstoffen,
het weefsel is dan negatief geladen
Deze 2 termen kunnen de aankleuring van kern, cytoplasma en tussencelstof voor
een groot gedeelte verklaren.
bijv. DNA en RNA met hematoxyline
Acidofiel = weefselonderdeel dat een hoge affiniteit voor zure kleurstoffen vertoont,
deze worden gebonden door positief geladen delen van het weefsel.
bijv. eiwitten met eosine
Chromofoob = weefselonderdeel dat geen geladen groepen bevat (niet + of -)
Bijv. Cytoplasma van slijmbekercellen heeft bij HE geen kleur, maar bij AB is het
slijm in de cellen wel negatief geladen. Bij PAS wordt gebruik gemaakt van de
aanwezigheid van koolhydraten in het slijm.
, Voor LM is HE-kleuring de meest gangbare kleuring.
DNA en RNA kleuren met hematoxyline donkerblauw en worden basofiel genoemd.
Eiwitten kleuren lichtroze met eosine en worden acidofiel of eosinofiel genoemd
Lichtmicroscopie
Helderveldmicroscopie = maakt gebruik van normaal, wit licht. De aangekleurde
celonderdelen in de coupe komen met deze methode naar voren (andere zijn
donkerveldmicroscopie of polarisatiemicroscopie)
Fluorescentiemicroscopie = gebruikt UV-licht (met kleine golflengte) om
fluorescerende moleculen in een coupe op te sporen op grond van hun emissie van
licht en langere golflengte. Hiermee kunnen natuurlijke of aangebrachte moleculen
en specifieke probes worden opgespoord
