Samenvatting
Samenvatting TIP! Hoorcolleges MBT 1 tm 6
- Vak
- MBT (B05MBT)
- Instelling
- Hogeschool Leiden (HSL)
Samenvatting van de hoorcolleges 1 tm 6 van MBT. HC9 tm 12 ook te koop
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 44 pagina's
Voorbeeld 4 van de 44 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Voorbeeld van de inhoud
MBT TENTAMEN HOORCOLLEGESInhoud
Table of Contents
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen......................................................................................1
Informatie over de PCR techniek en het ontwerpen van primers................................................................7
Hoorcollege 3 Kloneren, kennisclips controleren, in frame, oriëntatie.....................................................11
Hoorcollege 4 Transfecteren en transformeren........................................................................................18
Hoorcollege 6 Real-time qPCR...................................................................................................................23
MBT WC6 HC5 DNA/RNA isolatie..............................................................................................................31
MBT WC8 HC7 Sequencen.........................................................................................................................36
MBT WC2 HC en kennisclips
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen
,Overzicht
- DNA replicatie
- PCR
- Primers
- Primers ontwerpen
- Polymerase
- DNA template
Wat doet een PCR?
Vermeerderd/amplificeert een specifiek stuk DNA
Toepassingen
- Gen of promotor kopiëren om te kloneren
- Mensen, dieren en virussen identificeren
- Aanwezigheid specifieke DNA sequentie aantonen
- Aantonen van genetische ziekten
- Identificeren van bacteriële infectie
Waarop is PCR techniek gebaseerd?
DNA replicatie
- Helicase zorgt ervoor dat twee strengen uit elkaar gaan
- Primers worden gemaakt door primase, maakt RNA primers op
willekeurige plekken aan primer bindt polymerase om DNA
te kopiëren
o DNA polymerase beweegt over DNA van 3’naar 5’
o DNA polymerase maakt nieuwe DNA van 5’naar 3’
Waarmee maak je een PCR reactie specifiek?
Door primers te ontwerpen en te bestellen artificiële DNA primers (oligo’s)
Benodigheden PCR
- PCR machine
- PCR reactievaatjes
, - PCR reactiemengel
o DNA (template)
o 2 primers (forward en reverse)
o Nucleotiden
o Taq polymerase hittestabiel, geen proofreading activiteit
Proofreading een polymerase die zijn eigen fouten hersteld/fouten uit DNA
streng haalt
o Buffer
- Analyse systeem: bijv agarose gel
PCR hoe werkt het?
1 Cyclus
1. Denaturatie (uitsmelten) 96 graden
2. Annealing (hybridisatie/plakken primer) 50-65 graden
3. Extensie (elongatie/maken DNA door polymerase) 72 graden met Taq Polymerase*
*in een cel is de temperatuur 37 graden met polymerase (Polα, Polδ, Polɛ)
Na n cycli heb je 2n keer zoveel materiaal
- Tussen elke stap detectie fluorescentie
Ontwerpen van primers
Primers
- Korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nucleotiden)
- Andere naam: oligo’s
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie is te maken
- Specifiek
Algemene regels voor design primers
, - 3’-end moet G of C zijn (sterke binding 3 H-bruggen, polymerase bindt beter)
- 17-28 baseparen
- 40-60% GC
- Primer dimeren voorkomen (primers zitten aan elkaar)
- Voorkom interne “self-annealing’
- Tm tussen 55 en 70 graden
o Tm = gemiddelde temperatuur waarin helft primers binden, 50% bindt nog aan target
sequentie
o Tm bereken voor 15-25 basen:
Tm= 2(A+T) + 4(C+G)
(A, T, C, G aantal van deze basen)
Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Te lage annealingstemperatuur a-specifieke PCR producten en/of meerdere PCR producten
- Temperatuur niet hoog genoeg waardoor verschillende basen niet ontkoppeld worden
Verschillende tijden voor amplificatie DNA
- Hoe groter het PCR product, hoe langer het duurt
- Sommige polymerases zijn langzaam
- Sommige stukken DNA zijn moeilijk te amplificeren (zeldzaam)
Taq DNA polymerase heeft geen proofreading. Pwo en Pfu DNA polymerases hebben wel proofreading
activiteit. Polymerases worden geïsoleerd uit archeabacteria. Door proofreading wordt activiteit
langzamer, maar wel met minder fouten.
Voorwaarde template DNA
- Meestal wordt DNA gezuiverd
- Geen remmers van DNA polymerase
o Bijvoorbeeld heemgroep in hemoglobine, humuszuur in aarde
- Target bereikbaar voor primers en Taq
- Geen EDTA (of hele lage concentratie): Mg2+
- Niet teveel fragmentatie/afbraak
- Niet te vaak vriezen/ontdooien
Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën (ook tijdens de opzuivering en analyse)
Kennisclip primer ontwerp met de hand
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper silke10. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,92. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 50064 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen